鐮孢菌枯萎病\\(Fusarium wilt） 是普通菜豆\\(Phaseolus vulgaris L. ） 維管束類病害的一種，是由尖鐮孢菌菜豆?；蚛\(Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli） 引起的典型土傳真菌病害，在適宜的發病年份和地區，給普通菜豆生產帶來極大危害。該病害在我國北方俗稱死秧，露地和保護地栽培中均可發生，發病后死苗率在 30% ~ 50% 以上，嚴重時高達 90% ,給普通菜豆的生產帶來嚴重威脅.

植物激素是調節植物應答病原菌侵染相關防御反應的重要信號分子，深入了解植株激素在植物信號傳導過程中的作用，對了解植物抗病機理，提高植物的抗病性有重要的意義。水楊酸\\(SA,salicylic acid） 是一種小分子酚類代謝物，是許多植物系統抗病反應的重要信號分子,涉及并參與植物的過敏反應\\(HR,hypersensitive reac-tion） 和系統獲得性抗性反應 \\(SAR,systemic ac-quired resistance） ,在植物的抗病信號轉導中起著關鍵作用.病原菌的浸染不僅導致植物被侵染部位 SA 的積累，同時在未侵染的部位也積累了大量的 SA,從而最終誘導 SAR 的產生,因此 SA 表現出對植物抗病性的調節作用在很久前就已經吸引了科學家的關注。苯丙氨酸解氨酶\\(PAL,phenylalanine ammonia lyase） 是苯丙素途徑的關鍵調控因子，在植物免疫應答反應中調節SA 合成時發揮重要的作用.PAL 基因的表達在植物與病原菌互作過程中被快速誘導，而抑制PAL 的活性直接導致了擬南芥 \\(Arabidopsis ） 對Hyaloperonospora arabidopsidis 抗病反應體系的瓦解.此外，活性氧的爆發\\(Oxidative burst） 是植物與病原菌互作過程中的典型現象，主要表現為H2O2等活性氧分子含量的突增。大量研究表明，活性氧的產生是植物 HR 反應誘導的細胞程序化死亡所必需的過程。盡管植物活性氧的產生機制尚不十分清楚，但植物中過氧化物酶\\(POX,peroxidases） 被認為是活性氧的主要產生來源，而且已經被證明是調節胞外H2O2水平的重要分子。

本研究通過外源植物激素處理的方法，分析普通菜豆應答不同激素處理而引起的鐮孢菌枯萎病抗病性的變化，并對 SA 處理后普通菜豆根組織中 PAL、POX 活性和 SA、H2O2含量等植物抗病相關生理指標進行分析，通過體外試驗驗證不同植物激素對枯萎病原菌生長的直接抑制活性，以期為普通菜豆鐮孢菌枯萎病抗病機理的研究奠定理論基礎。

1、 材料與方法

1. 1 試驗材料

普通菜豆感病品種 BRB-130 由中國農業科學院作物科學研究所食用豆種質資源課題組提供，將普通菜豆種子播種于滅菌的營養土\\(粘土∶ 蛭石 =1∶ 3,V / V） 中，23 ~ 28℃ 溫室條件下，12 h 光照，培養7 ~ 10 d 的幼苗用于接種； 枯萎病原菌尖鐮孢菜豆?；?FOP-DM01 菌株由中國農業科學院作物科學研究所作物資源抗病蟲鑒定與檢疫課題組保存，病原菌首先接種于 PDB\\(Potato dextrose broth） 培養基中，27 ℃，150 r/min 培養 3 d,培養基經過濾制備成孢子懸浮液，4 ℃保存備用。

1. 2 植物激素處理

普通菜豆幼苗采用灌根法或噴霧法進行不同植物激素的處理，以0. 02% Tween 20 作為溶劑。水楊酸\\(SA） 、茉莉酸甲酯\\(MeJA） 和乙烯利\\(ETH） 濃度為 2 mmol/L,采用 0. 02% Tween 20 作為對照。灌根法每日澆灌50 mL,連續處理7 d; 噴霧法每日噴1次，連續處理 7 d.

1. 3 病原菌的接種與檢測樣本的采集

采用薛仁風等和 S. Mandal 等的方法接種病原菌，前者采用灌根法用于鑒定不同植物激素對普通菜豆抗病表型的影響； 后者采用噴霧法用于研究外源激素對普通菜豆抗病生理生化指標的影響，將培養病原菌的 PDB 培養基用培養液稀釋至濃度為 5. 0 ×105cfu / mL.營養液培養的普通菜豆植株分別用 0 mmol/L 和 2 mmol/L SA 連續處理葉片7 d,在處理 48 h 后轉移至病原菌孢子濃度為 5. 0 ×105cfu / mL 的營養液中繼續培養，設對照和處理共 4組： \\(1） 不接菌不用 SA 處理； \\(2） 接菌不用 SA 處理； \\(3） 不接菌僅用 SA 處理； \\(4） 接菌并用 SA 處理。植株放置于溫室中培養，12 h 光照，溫度 25 ±2 ℃ .分別在 SA 處理后 0 h、48 h、96 h 和 144 h 采集普通菜豆根組織樣本作為試驗材料。

1. 4 普通菜豆發病情況的調查

參考王述民等普通菜豆枯萎病 1 ~9 級的病情分級標準，1 級： 植株生長正常； 3 級： 植株上約10% 葉片萎蔫或黃化； 5 級： 植株上約 25% 葉片萎蔫或黃化，植株輕度矮化； 7 級： 植株上 50% 葉片萎蔫或黃化，植株嚴重矮化； 9 級： 植株枯萎死亡。

1. 5 PAL 和 POX 活性的測定

PAL 活性的測定參照 G. Z. Qin 等的方法，稱取 100 ~150 mg 普通菜豆根組織，加入液氮研磨成粉末。用 50 mmol/L 硼酸鈉緩沖液\\(pH = 8. 8,含5 mmol / L巰基乙醇和 1% PVP） 溶解勻漿，使終濃度達到 0. 1 mg/μL \\(FW/V） ,將混合物在 4 ℃ 下、12000 r / min離心 30 min,取上清液測定酶活性。在0. 1 mL 粗酶液中加入 4 mL 硼酸緩沖液\\(50 mmol / L,pH = 8. 8） ,再加入 1 mL L-苯丙氨酸\\(20 mmol / L） ,在 37 ℃ 水浴 60 min.反應用 0. 2 mL 的 3 mol/LHCl 中止。以不加酶液為對照，在 290 nm 下比色。

用肉桂酸作為標準品繪制標準曲線，酶活力變化以nmol / min·mg FW 為單位表示，重復 3 次。

POX 活性的測定參照 R. Hammerschmidt 等方法，取普通菜豆根組織 100 ~150 mg,分別加入預冷 10 mmol/L 磷 酸 緩 沖 液 \\(137 mmol/L NaCl,2. 7 mmol / L KCl,9. 8 mmol / L Na2HPO4,1. 7 mmol/LKH2PO4,pH = 7. 4） ,充分勻漿，使各樣品濃度均為0. 1 mg / μL \\(FW / V ） ,4 ℃ 條 件 下 靜 置 30 min,13800 r / min離心 20 min.反應體系包括 2. 9 mL 含有 1. 25% \\(V/V） 愈創木酚和 0. 1 mol/L H2O2的磷酸緩沖液，加入 100 μL 酶粗提液，混合均勻后于25 ℃ 條件下反應 5 min,470 nm 波長下讀取吸光值\\(OD 值） .1 個酶活力單位\\(U） 定義為 1 min 內1 μmol底物的減少量或產物的生成量。酶活力變化以 μmol/min·mg FW 為單位表示，重復 3 次。

1. 6 H2O2含量的測定

植物組織中 H2O2含量的測定參照 S. Sagisaka方法。100 ~ 150 mg 根 或 莖 分 別 加 入 預 冷 的0. 01 mol / L磷酸緩沖液\\(pH = 7. 4） 及 5% 三氯乙酸\\(TCA） 的混合溶液\\(V/V =1/0. 7） 勻漿，使終濃度為0. 1 mg / μL,4 ℃ 條件下，10625 r / min 離心 10 min.離心后取上清液1. 6 mL 加入0. 4 mL 50% TCA、0. 4 mL10 mol / L 硫酸亞鐵銨和 0. 2 mL 2. 5 mol / L硫氰酸鉀，混合溶液離心后在 480 nm 波長紫外光下測定吸光值。用植物 H2O2標準品繪制標準曲線，計算待測樣品中 H2O2的含量。

1. 7 普通菜豆根中 SA 的定量分析

參照 Plant Salicylic Acid\\(SA） ELISA Kit\\(Rapid-bio,USA） 說明書進行。

1. 8 化學信號分子抑菌活性的測定參考 S. Mandal 等方法，在含有 PDA 的直徑9 cm 培養皿中分別涂布濃度為 1. 0 mmol / L、2. 0 mmol / L、3. 0 mmol / L 的 SA、MeJA 和 ETH 溶液各 100 μL,以滅菌水和 0. 02% Tween 20 作為對照，每個培養皿接種 1 個直徑為 5 mm 的病原菌菌餅，7 d后測量并記錄菌落直徑。

2、 結果與分析

2. 1 不同植物激素對普通菜豆抗病性的影響

SA、MeJA 和 ETH 處理普通菜豆幼苗，并觀察其對枯萎病抗性的影響。結果表明，MeJA、ETH 處理降低普通菜豆枯萎病的抗性，接種病原菌 10 d 后，對照植株發病級數為 2. 8 ,SA 處理的普通菜豆植株發病級數為 1. 8 ,SA 處理和對照植株的發病癥狀均不明顯；MeJA 和 ETH 處理的普通菜豆植株葉片明顯褪綠變黃，發病級數分別達到 7. 3 和 7. 8; MeJA 和 ETH 處理的未接病原菌植株的生長未受影響； 外源 SA 處理能夠顯著提高普通菜豆枯萎病抗性，接種病原菌 21 d 后，未經 SA 處理的植株葉片萎蔫變黃，根和莖的維管素變褐，發病級別達到 7. 0 ,而用 SA 處理的普通菜豆植株葉片枯萎和維管素變褐程度較輕，發病級別為 3. 3 ,經過 SA 處理的未接病原菌植株的生長情況同樣未受影響。

2. 2 PAL 和 POX 酶活的測定

PAL 和 POX 與普通菜豆應答枯萎病原菌 FOP-DM01 菌株侵染密切相關。結果表明，在接種枯萎病原菌后 48 h、96 h、144 h,2 mmol/L SA 處理的普通菜豆根中 PAL 和 POX 活性均顯著高于未經 SA處理和未接種病原菌的對照。PAL 和 POX 活性同在144 h 達到最高值，分別為 0. 066 nmol / min·mg FW 和18. 1 μmol / min·mg FW ,差異均為極顯著\\(P <0.01） .本研究表明，SA 顯著誘導普通菜豆根中PAL 和 POX 活性的升高，從而增強了普通菜豆對病原菌的抗病性。

2. 3 H2O2含量的測定

普通菜豆根中 H2O2含量受 SA 誘導發生不同程度 的 變 化 .在 SA 處 理 后 48 h 和144 h,接種病原菌的普通菜豆根中 H2O2含量顯著高于未經 SA 處理和未接種病原菌的對照，其中 144 h 時達到最高，為 0. 113 ng/mg FW,差異顯著\\(P < 0. 05） .研究表明，在普通菜豆激發的防御反應中 H2O2發揮著重要的作用，通過提高根組織內 H2O2的水平顯著增強了寄主對枯萎病原菌的抗性。

2. 4 普通菜豆根中游離 SA 的定量分析

參照 Plant Salicylic Acid\\(SA） ELISA Kit\\(Rapid-bio,USA） 說明，檢測鮮重普通菜豆根中 SA 含量.結果表明，SA 處理后 48 h 普通菜豆根中 SA 含量沒有明顯差異。接種病原菌后，在 96 h 和 144 h,經 SA 處理并接種病原菌的普通菜豆根中 SA 含量顯著高于未經 SA 處理和未接種病原菌的對照，平均值分別達到 0. 76 ng/g FW 和 0. 86 ng/g FW\\(P <0. 05） ,而經過 SA 處理的未接種病原菌植株根中SA 含量雖高于其他 2 組未經 SA 處理的植株，但差異并不顯著，說明在接種病原菌后，外源 SA 的誘導顯著提高了普通菜豆根中的 SA 含量，從而激活了寄主內 SA 介導的相關防御反應，增強了普通菜豆的免疫力。

2. 5 植物激素抑菌活性的測定

FOP-DM01 菌株在 PDA 培養基上的生長不受Tween 20、SA、MeJA 和 ETH 的影響，并且滅菌水和 Tween 20 以及濃度分別為 1. 0 mmol/L、2. 0 mmol / L和 3. 0 mmol / L 的植物激素對病原菌菌落直徑的變化也沒有明顯的影響\\(圖 4B） .研究結果表明，SA、MeJA 和 ETH 對 FOP-DM01 菌株的生長沒有直接抑制作用。

3、 討論與結論

SA 作為典型的植物信號分子在植物系統抗性體系中具有非常重要的作用.相關研究表明，200 μmol / L SA 處理番茄顯著地提升了寄主葉中 SA的含量，從而激發了寄主對 Alternaria solani 的系統抗性; 外源 SA 預處理擬南芥植株能夠有效地提高寄主對 F. oxysporum 的抗病性; 外源 SA 激發了鷹嘴豆對尖鐮孢枯萎病原菌的系統抗性，顯著降低了寄主的發病級別; 此外，SA 同樣被證明在番茄中對 Botrytis cinerea 的基礎抗性也具有非常重要的作用.本研究直接在普通菜豆葉片表面噴施2 mmol / L SA,從而顯著提高了植株根中 SA 的含量，增強了植株對枯萎病原菌 FOP-DM01 菌株的抗病性。體外試驗結果表明，SA 對 F. oxysporum f. sp.phaseoli 并沒有直接的抑菌活性，這說明 SA 是通過激活植株 SA 介導的相關信號傳導途徑，從而誘導抗病相關基因的表達。C. Y. He 等觀察到 SA 對F. oxysporum f. sp. asparagi 沒有直接的抗菌活性，植物抗病性的提高是寄主本身防御反應被 SA 激活的結果，該結論進一步證明了 SA 是通過激活植物SAR 反應達到抵抗病原菌侵染的目的。

PAL 參與了植物免疫系統中許多重要化合物的合成，標志著植物抗病反應發生.當植物受病原物侵染或受激發子誘導時，組織中 PAL 和 POX 活性會迅速升高，如： 番茄根組織在受 F. oxysporum f. sp.1142lycopersici 激發子誘導條件下，PAL 和 POX 的活性顯著升高.SA 誘導蘆筍 PAL 和 POX 活性的升高使寄主的細胞壁增厚從而抑制了 F. oxysporum f. sp.asparagi 的侵入.本研究通過 SA 處理普通菜豆葉片，誘導根組織中 PAL 和 POX 活性顯著升高，從而增強了普通菜豆對 FOP-DM01 菌株的防御能力。

此外，植物中 H2O2、O–2、OH·和 HO2等活性氧\\(ROS）的爆發已經被證明是發生在植物體受病原物侵染的早期抗性反應過程中.N. Doke最早觀察到馬鈴薯與 Phytophthora infestans 互作的過程中有 ROS的產生。本研究通過外源 SA 的誘導使普通菜豆根組織中 H2O2的含量顯著升高，從而激活了植物早期應答病原菌侵染的 HR,進而誘導整株普通菜豆SAR 的發生。因此，伴隨劇烈氧化反應而釋放的大量 ROS 是植物細胞應對外界病原物侵染而激發的快速反應的標志。

本研究利用植物激素 SA、MeJA、ETH 通過體外處理的方法研究普通菜豆鐮孢菌枯萎病抗病相關信號傳導途徑。本試驗中普通菜豆對枯萎病菌的抗性被 SA 顯著誘導增強，而 MeJA 與 ETH 處理則降低了寄主的抗性，并且 SA、MeJA 和 ETH 在體外對病原菌的生長沒有明顯的抑制作用。此外，SA 處理普通菜豆葉片使植株根中 SA 的含量升高，誘導普通菜豆根組織中 PAL 和 POX 活性以及 H2O2的含量也顯著升高，從而激發了寄主早期應答病原菌侵染的HR,誘導整株普通菜豆產生 SAR,從而增強了普通菜豆對 FOP-DM01 菌株的抗性。因此，SA 是普通菜豆鐮孢菌枯萎病抗病反應中潛在的重要信號分子，能夠顯著提高普通菜豆對鐮孢菌枯萎病的抗病性，為普通菜豆枯萎病抗病機理的研究奠定基礎。

參考文獻：
[1] 杜永剛，李昶。 菜豆枯萎病的發生與綜合防治[J]. 吉林蔬菜，2008\\(4） : 89.