載脂蛋白 E\\( apolipoprotein E，Apo E\\) 是一種多態性蛋白，參與脂蛋白的轉化與代謝過程，其基因可以調節多種生物學功能。Apo E 基因敲除后，小鼠的 B 淋巴細胞及 T 淋巴細胞發生改變，ApoE 在造血干祖細胞中表達豐富，Apo E 基因敲除小鼠喂飼高脂、高膽固醇飼料后，造血干祖細胞顯著增多，這說明在高脂、高膽固醇可以誘導 Apo E基因敲除小鼠造血干祖細胞增殖。那么在沒有高脂、高膽固醇誘因下，Apo E 基因對小鼠造血干祖細胞有沒有影響呢?
造血干細胞是所有成熟血細胞維持的重要因素。在生理狀態下，造血干細胞面臨多種命運選擇: 自我更新、分化、凋亡、靜息或遷移，這些選擇之間的平衡決定了造血干細胞的功能。不同命運的選擇是由內在\\( 細胞周期、凋亡等相關基因\\) 和外在\\( 微環境\\) 的調控機制共同決定的。但是造血干細胞維持自我更新和選擇分化的具體機制還不清楚。
那么 Apo E 對造血系統有怎樣的作用，是否會影響骨髓造血干細胞\\( hematopoietic stem cell，HSC\\)的發育分化呢? 為了解 Apo E 基因敲除是否會影響HSC，我們應用 Apo E 基因敲除小鼠及同窩野生對照小鼠進行了相關分析。
1 材料和方法
1. 1 動物與設備
Apo E 基因敲除小鼠來自北京協和醫學院比較醫學中心，遺傳背景為 C57B6/L，對照小鼠為同窩野生型小鼠，動物生產及使用許可證號: SCXK\\( 京\\)2009 － 0007; SYXK \\( 京\\) 2011 － 0022。動物飼養在SPF 動物房，喂飼 SPF 級小鼠維持飲料。主要實驗設備為美國 BD 公司 Aria 流式細胞儀。
1. 2 PCＲ 方法鑒定 Apo E 基因敲除小鼠基因型
用 10 日齡小鼠尾尖提取基因組 DNA，普通PCＲ 鑒定基因型。反應條件: 94℃ 預變性 3 min;94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 30 s，35 個循環; 72℃ 延伸10 min。 基 因 敲 除 小 鼠 的 PCＲ 鑒 定 引 物:OIMＲ0180: 5` GCC TAG CCG AGG GAG AGC CG 3`，OIMＲ 0181: 5` TGT GAC TTG GGA GCT CTG CAG C3`，OIMＲ 0182: 5` GCC GCC CCG ACT GCA TCT 3`，PCＲ 產物長度，野生型為 155 bp，Apo E 敲除為 245bp，雜合子同時有上述 2 條片段。引物由上海英駿生物工程技術有限公司合成，PCＲ 試劑購自寶生物工程有限公司。
1. 3 流式分析
小鼠 2 月齡時脫頸椎處死，取外周血、胸腺、脾臟、后肢骨，置于冰上預冷的染色緩沖液\\( 含 1%BSA 的 PBS\\) 中。胸腺、脾臟用磨砂玻片研磨成細胞懸液; 后肢骨用 5 mL 注射器將骨髓細胞沖出，并吹打成細胞懸液。將細胞懸液用 50 μm 尼龍濾膜過濾后收集到 15 mL 離心管中，用 PBS 定容至10 mL，混勻后，取 10 μL 細胞懸液，稀釋 10 倍后計數細胞數。細胞懸液離心，1000 r/min，10 min，將細胞濃度調整為 1 ×108個細胞/mL。分別取 106細胞標記熒光抗體\\( BD 公司\\) 。
骨髓造血干細胞的分析中用如下抗體進行標記: CD34-FITC、Flt3-PE、CD16/32- Pcrcp-cy5. 5、Sca1- PE-Cy7、cKit- APC、Ter-119- Biotin、Gr-1-Biotin、Mac-1- Biotin、B220- Biotin、IL-7Ｒ- Biotin、CD4- Biotin、CD8- Biotin、Biotin - APC-Cy7。骨髓造血干細胞\\( HSC\\) 表面標記為: lin-c-kit+sca1+，長期造血干細胞 \\( LT-HSC\\) 表面標記為: Lin- c-Kit+Sca1+CD34-Flt3－，短期造血干細胞\\( ST-HSC\\) 表面標記為: Lin-c-Kit+Sca1+CD34+Flt3－，髓系祖細胞\\( MP\\) 表面標記為: Lin-c-Kit+Sca1－，共同髓系祖細胞\\( CMP\\) 表 面 標 記 為: Lin- c-Kit+Sca1－CD34+CD16 /32low，粒單系祖細胞\\( GMP\\) 表面標記為: Lin-c-Kit+Sca1－CD34+CD16 /32high，巨核單系祖細胞\\( MEP\\) 表面標記為: Lin-c-Kit+Sca1－CD34－CD16 /32low，淋系共同祖細胞\\( CLP\\) 的表面標記為: Lin-c-kitlow Sca1lowCD34+IL － 7Ｒ+。IgD-FITC、CD43-PE、B220-PE-Cy7、IgM-APC，標記不同發育階段的 B 淋巴細胞。脾臟及外周血細胞標記抗體: CD4-FITC、CD8- Pcrcp-cy5. 5、B220-PE-Cy7、CD11B- APC-Cy7。
上述抗體加入細胞懸液，冰上避光，30 min; 加 1 mL染色緩沖液，離心，2600 r/min，5 min，棄上清，加200 μL 染色緩沖液重懸細胞，用 50 μm 尼龍濾膜過濾，冰上避光備用。
1. 4 統計分析方法
數據分析采用 SPSS13. 0 軟件包進行統計分析，各組數據均采用 x珋 ± s 表示。組間資料分析采用 t檢驗。以 P ＜ 0. 05 表示差異有統計學意義。
2 結果
2. 1 PCＲ 鑒定結果
剪取 10 日齡小鼠腳趾，采用飽和氯化鈉法提取小鼠基因組 DNA，進行 PCＲ，產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，野生型產物長度為 155 bp，Apo E 缺失產物長度 245 bp?；蛐丸b定結果\\( 圖 1\\) 。2. 2 Apo E 基因敲除小鼠外周血 B 細胞、T 細胞減少
我們取 Apo E 基因敲除小鼠及同窩野生對照小鼠的外周血進行分析，發現 Apo E 基因敲除小鼠外周血中 B220+細胞\\( P ＜ 0. 05\\) 及 T 淋巴細胞\\( P ＜0. 01\\) 顯著減少，而 CD11b+細胞則沒有顯著變化\\( P＞ 0. 05\\) 。2. 3 Apo E 基因敲除對小鼠骨髓及脾臟中 B220+細胞的影響Apo E 基因敲除小鼠外周血中 B220+細胞減少，本研究對骨髓及脾臟的細胞進行了分析，同時對骨髓中前體 B 細胞的發育也進行了分析。結果發現，Apo E 基因敲除小鼠脾臟 B220+細胞減少\\( P＜ 0. 05\\) ，但是骨髓中 B220+細胞無顯著改變\\( P ＞0. 05\\) 。同時，骨髓中前體 B 細胞的發育也沒有顯著變化\\( P ＞0. 05\\) 。
2. 4 Apo E 基因敲除小鼠 T 細胞變化
Apo E 基因敲除小鼠外周血 T 淋巴細胞減少，為了解骨髓及脾臟 T 淋巴細胞的變化，本研究分析了骨髓、脾臟中 CD4+、CD8+細胞。結果發現，脾臟中 CD4+細胞比例增多\\( P ＜0. 01\\) ，而 CD8+細胞比例降低\\( P ＜0. 05\\) ; 骨髓中則未發現顯著變化\\( P ＞0. 05 圖 4A\\) 。為進一步了解 Apo E 基因敲除對小鼠 T 淋巴細胞發育的影響，我們分析了胸腺 T 淋巴細胞，結果顯示，各階段 T 淋巴細胞的比例沒有顯著變化\\( P ＞0. 05\\) 圖4B\\) 。這說明，Apo E 基因敲除對 T 淋巴細胞發育沒有顯著影響。2. 5 Apo E 基因敲除對骨髓造血干細胞的影響
為了解 Apo E 基因敲除對小鼠骨髓造血干細胞的影響，本研究分析了 Apo E 基因敲除小鼠及同窩野生對照小鼠骨髓造血干細胞的數量，發現 Apo E基因敲除小鼠短期造血干細胞\\( ST-HSC\\) 數量顯著增加\\( P ＜ 0. 05\\) ，長期造血干細胞\\( LT-HSC\\) 、多潛能造血祖細胞\\( MPP\\) 及淋系共同祖細胞\\( CLP\\) 則沒有顯著變化\\( P ＞0. 05\\) 。造血干細胞的功能是否改變，則需進行骨髓移植實驗來深入研究。
3 討論
已有研究表明，Apo E 基因參與免疫調節作用，Apo E 基因敲除小鼠的體液免疫及細胞免疫均發生改變。Apo E 基因敲除小鼠在 3 月齡時已出現脂肪條紋，即動脈粥樣硬化早期的損傷性表現。本研究中采用 2 月齡小鼠作為研究對象喂飼正常小鼠維持飼料，避免了 Apo E 基因敲除所致疾病對研究目標的影響。本研究發現，Apo E 基因敲除后小鼠造血系統 B220+、CD4+、CD8+淋巴細胞在外周組織中發生變化，骨髓短期造血干細胞顯著增加\\( P ＜0. 05\\) ，但是骨髓長期造血干細胞及胸腺 T 細胞則沒有顯著變化\\( P ＞0. 05\\) 。這說明 Apo E 基因可能通過免疫調節作用影響 B220+、CD4+、CD8+淋巴細胞。Apo E 基因對骨髓造血干細胞的自我更新及分化功能是否有影響，尚需應用競爭性骨髓移植、體外克隆形成實驗等進一步深入研究。
參考文獻:
［1］ Ｒeue KL，Quon DH，O ＇Donnell KA，et al． Cloning andregulation of messenger ＲNA for mouse apolipoprotein E． TheJournal of biological chemistry ［J］． 1984， 259 \\( 4 \\) : 2100－ 2107．
［2］ Ali K，Middleton M，Pure E，et al． Apolipoprotein E suppressesthe type I inflammatory response in vivo． Circulation research［J］． 2005，97\\( 9\\) : 922 －927．
［3］ Murphy AJ，Akhtari M，Tolani S，et al． ． ApoE regulateshematopoietic stem cell proliferation，monocytosis，and monocyteaccumulation in atherosclerotic lesions in mice． The Journal ofclinical investigation［J］． 2011，121: 4138 － 4149．
［4］ Kobayashi M，Srour EF． Ｒegulation of murine hematopoieticstem cell quiescence by Dmtf1． Blood［J］． 2011，118: 6562－ 6571．
［5］ Pietras EM，Warr MＲ，Passegue E． Cell cycle regulation inhematopoietic stem cells． The Journal of cell biology［J］． 2011，195: 709 － 720．［6］ Laskowitz DT，Lee DM，Schmechel D，et al． ． Altered immuneresponses in apolipoprotein E-deficient mice． Journal of lipidresearch［J］． 2000，41: 613 － 620．
