肺挫傷是創傷病人中常出現的一種閉合性損傷，創傷導致的肺組織出血、水腫是急性呼吸窘迫綜合征的主要危險因素，老年患者由于身體各項功能都出現衰退趨勢，加上基礎疾病較多，因此病情更加復雜、兇險，顯著加大了救治難度〔1〕，早期采取有效措施減輕肺水腫對于改善患者預后具有重要意義〔2，3〕，研究肺挫傷水腫的機制，對于肺挫傷患者的臨床治療具有重要的指導意義。本研究檢測水通道蛋白\\( AQP\\) 1 和 4 在挫傷肺組織中的表達變化，探討肺水腫的形成機制。
1 材料和方法
1. 1 肺挫傷模型制作及分組
健康老年雄性 SD 大鼠 100 只，體重 450 ～500 g，由昆明醫科大學實驗動物中心提供。肺挫傷模型采用金屬球自由落體打擊法制作，老年大鼠麻醉后放置于水平實驗臺上，180 g 重物自 1 m 高處自由落體，垂直撞擊于大鼠右側胸廓，于設定時間點麻醉后斷頭處死，分為四組: 假手術組，模型 1、3 和 6 h 組，每組 25 只，其中 10 只做水含量測定，10只做分子生物學檢測，5 只做組織病理檢測。
1. 2 肺組織含水量的測定
大鼠麻醉后取肺組織，稱量右肺中葉肺組織濕重，后置于 100℃ 恒溫鼓風干燥箱中干燥 2 d 后稱重，計為干重。根據下列公式計算肺組織水含量: \\( 濕重－干重\\) /濕重×100%。
1. 3 肺組織 HE 染色
取大鼠右肺上葉組織，4% 多聚甲醛固定后，切片，常規脫水、脫蠟，行 HE 染色。
1. 4 RT-PCR
根據標準的 RNA 提取步驟提取總 RNA，使用反轉錄試劑盒\\( Promega\\) 進行反轉錄，具體操作根據說明書進行。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測各組 AQP1 和4 的表達，以 β-ac-tin 作為內參照，Image J 軟件定量分析各電泳條帶的灰度值，RT-PCR 產物以各樣本目的基因與 β-actin 的灰度值進行比較，AQP1 上游引物序列: 5'-AAAGTGGCAAGGAAGGGACA-3'; 下游引物序列: 5'-GCTGTGGATGTTGGGAAAGAG-3'。AQP4 的上游引物序列: 5'-TTGGACCAATCATAGGCGC3'; 下游引物序列:5'-GGTCAATGTCGATCACATGC-3'; β-actin 上游引物序列: 5'-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3'; 下游引物序列: 5'-CATCT-GCTGGAAGGTGGACA-3'。
1. 5 Western 印跡分析
老年大鼠 100 mg 肺組織加入裂解液勻漿，冰上碾磨勻漿后，12 000 r/min 離心 10 min 取上清，BCA法蛋白定量，取蛋白樣品 50 μg，電泳后轉膜，5%的脫脂奶粉封閉 1 h，β-actin、AQP4 和1 抗體\\( 均購自美國 Santa cruz 公司\\) 稀釋液孵育\\( 1 ∶200\\) ，4℃過夜，TBST 洗膜，5% 的牛奶稀釋的辣根過氧化物酶標記的兔抗羊二抗，洗膜后，按照 ECL 說明書，1 ∶1配置發光工作液，凝膠成像儀成像。
1. 6 統計學分析
采用 SPSS17. 0 軟件進行單因素方差分析及 LSD-t 檢驗。
2 結 果
2. 1 肺組織濕 /干重比和病理改變
模型 1、3、6 h 組濕 /干比重\\( 0. 932 4±0. 079 6、1. 537 8±0. 071 3、2. 378 0±0. 071 3\\) 顯著高于假手術組\\( 0. 799 1±0. 069 3\\) \\( P＜0. 05\\) 。模型 3、6 h 組與模型 1 h 組有顯著差異\\( P＜0. 05\\) 、挫傷后 1 h 組織肺泡腔內未出現明顯水腫液，3 h 后，光鏡下見挫傷肺組織間質出現明顯腫脹，肺泡壁毛細血管出現明顯擴張、紅細胞外漏、水腫明顯，肺泡腔內出現少量水腫液; 挫傷后 6 h，黏稠液體充滿肺泡腔，肺泡間隔出現明顯水腫，有大量炎性細胞浸潤，假手術組未出現明顯異常。
2. 2 各組肺組織 AQP1 和 4 的 mRNA 和蛋白表達量
與假手術組相比，模型 3、6 h 組肺組織內 AQP1 和 4 mRNA 和蛋白表達明顯升高\\( P＜0. 05\\) 。與模型 1 h 組比較，模型 6 h 組有顯著差異\\( P＜0. 05\\) 。見圖 1 和圖 2，表 1?！緢D略.表1】
3 討 論
研究表明彌漫性肺泡損害、低氧血癥、挫傷區肺組織的血水腫、通氣與換氣功能障礙時肺挫傷的主要病理生理機制〔4〕，其中肺水腫是導致肺通氣功能障礙的主要原因，引起肺組織水腫的原因主要有兩方面: 一方面，創傷直接破壞血管內皮和肺泡上皮的屏障完整性，使通透性增加〔5〕; 另一方面，肺挫傷后繼發性產生的炎性介質，活性氧殘基導致肺泡水的清除能力明顯降低〔4〕。水代謝異常顯著降低了肺組織的順應性和氧合功能，是影響患者預后的重要因素。
研究證實 AQP 在肺挫傷后組織水腫形成中發揮重要作用，其中，AQP1 在肺挫傷后組織中的表達量明顯升高〔6〕，Verk-man 等〔7〕在敲除 AQP1 基因的研究發現，AQP1 參與滲透壓驅動的肺內水運動，能夠促進肺水腫的形成; 袁軍等〔6〕在大鼠肺挫傷模型中研究發現 AQP1 的表達在肺挫傷后明顯升高，可能是肺水腫的重要參與者。AQP4 蛋白最初在 1994 年從大鼠的肺組織中克隆出來的一種選擇性水轉運體，屬于汞不敏感性AQP 家族〔8〕，采用電鏡和免疫細胞化學技術檢測發現 AQP4 定位于肺組織的氣管、支氣管上皮及成纖維細胞的膜基質側頂部，此外 AQP4 也存在于氣管、支氣管的柱狀上皮的基質側，AQP4 在肺泡水的轉運及氣道表面液體的調整中發揮重要作用。Verkman 等〔7〕證實發現 AQP1 缺失可導致肺泡毛細血管間的水通透性下降 10 倍，AQP1 和 4 均敲除小鼠水通透性降低 14 ～16 倍。研究采用血管外肺水\\( EVLW\\) 技術發現，AQP4的主要作用是保持肺泡相對干燥，在正常狀態下表達較少，血管外肺水量的增加可以顯著誘導 AQP4 蛋白表達，以糾正“滲出-吸收”的失衡〔7，9〕。朱麗華等〔10〕在大鼠油酸性急性肺損傷模型中發現，AQP4 在油酸導致損傷的肺組織中表達明顯升高，這與本實驗的研究結果具有一致性，同時還證明早期使用腎上腺能 β2 受體激動劑特布他林可以上調肺泡Ⅱ型細胞 AQP4 表達，明顯減少肺泡腔滲出，減輕肺損傷，顯著減少細胞外肺水的含量，提示 AQP4 在肺泡水腫中可以加強水轉運發揮重要的抗水腫作用; 推測肺挫傷后 AQP4 表達升高，是一種肺挫傷后的代償性升高，可能利于減輕肺泡腔水腫。以往研究證實 AQP1在肺挫傷后表達也明顯升高，本研究結果與前期研究具有一致性〔11，12〕，AQP1 蛋白的表達增加則可以加重肺水腫，因此調節二者比值的平衡可能對于肺水腫早期的治療具有重要意義，未來還需要進一步使用敲除 AQP4 或 1 基因及兩者同時敲除的基因驗證二者在肺挫傷中肺水腫的作用。
參考文獻
1 李景華 . 老年人嚴重肺挫傷的治療體會〔J〕． 現代診斷與治療，2012; 23\\( 5\\) : 508-9.
2 羅玉龍，李超峰，蘇鵬霄 . 嚴重肺挫傷 150 例診治體會〔J〕． 吉林醫學，2009; 30\\( 19\\) : 2244-6.
