瘧疾是危害人體健康最嚴重的熱帶病之一。瘧原蟲經蚊子傳播，在人體主要寄生在紅細胞內（infected red blood cell,iRBC）并大量繁殖，破壞 RBC,引發一系列嚴重后果。在瘧疾的研究中，瘧原蟲感染的患者血液標本及鼠瘧模型的小鼠瘧原蟲血液是基本的研究材料。然而在實驗中首先面臨的問題是如何排除宿主血液中的白細胞（white blood cell, WBC）DNA 的干擾，得到純化的蟲體。宿主 WBC 的存在可影響實驗結果，在一定程度上增加研究難度、延長實驗時間和提高成本。因此，如何去除原蟲血樣中的宿主 WBC,是實驗成敗的首要環節，對瘧原蟲的分子生物學、免疫學等研究方面尤為關鍵。
有關瘧原蟲標本純化方法的探索，一直伴隨著瘧疾的研究不斷進行。隨著實驗技術的進步，純化方法也逐步更新。瘧原蟲的純化主要經歷了沉降法，洗滌法、離心法、纖維素柱層析法及過濾法等.純化方法的改進除了以去除宿主 WBC 為主要目標外，其操作的簡便性及低成本也是重要的指標。傳統洗滌法、離心法等對宿主 WBC 去除效果有限，已逐漸被柱層析法及過濾法所取代。CF-11 纖維柱法是最常用的方法，價格低廉，缺點是耗時費力;商品化的濾器 Plasmodipur 價格昂貴，且來源受限;文獻報道多需要結合兩種以上技術：如密度梯度離心結合 CF-11 纖維柱沉降法,淋巴細胞分離液離心法結合 plasmodipur 等.Trang等建立了一步磁珠法去除 WBC 的方法，簡便快捷，但需專用的器材，成本較高.Tao 等試制了無紡布（non-woven fabric,NWF）濾器用于間日瘧原蟲血的純化，與 CF-11 法比較取得滿意效果，而這種濾器形成產品還有待時日。
無紡布（NWF）具有吸附 WBC 的功能，作為過濾材料普遍用于臨床輸血前處理去除人體 WBC.目前去 WBC 輸血器已廣泛的用于國內外臨床輸血中的 WBC 過濾，在八十年代后開發出的以聚酯纖維無紡布作濾膜的第三代高效去 WBC 輸血器，其 WBC 去除率可達 99.9% 以上，而第四代 WBC 濾器的 WBC 清除可達 99.9999%以上。臨床用去 WBC 輸血器一般用于 50 mL以上的血液處理，而瘧原蟲血樣通常僅有幾毫升，每只小鼠可采集蟲血約為 1 mL 左右。那么臨床用去 WBC 輸血器能否直接用于瘧原蟲血樣尤其是小鼠瘧原蟲血樣的純化呢？尚未見相關實驗報道。為建立一種簡便、實用、去 WBC 效果好且低成本的瘧原蟲純化方法，本文采用臨床去白細胞輸血器對感染瘧原蟲的小鼠血液中的 WBC 去除效果進行了實驗探討。
1 材料與方法
1.1 一般材料
1.1.1 實驗動物及蟲株 雄性瑞士種昆明遠交系小鼠，6~8 周齡，體重 20~25 g,購于廣州中山大學實驗動物中心。伯氏瘧原蟲（Plasmodium berghei, Pb）ANKA 株由本室鼠鼠間血傳保種。
1.1.2 主要試劑與儀器 一次性去白細胞輸血器（型號 KF-WFR-B-200）購自成都市雙陸醫療器械有限公司；DNA 提取試劑盒、PCR 試劑及電泳分子質量標準均購自寶生物工程（大連）有限公司，PCR 儀（杭州博日），TDL-40B-II 型低速臺式離心機（江蘇無錫瑞江分析儀器公司）。
1.2 方法
1.2.1 動物分組與處理 39 只小鼠隨機分為 3 組：A 組（新鮮蟲血組，n=18）、B 組（凍存蟲血組，-80℃保存 6 個月，n=16）及 C 組（正常對照組，n=5）；A 組和 B 組每只小鼠分別由腹腔接種 200 mL1×107Pb 感染紅細胞，C 組腹腔注射 200 mL 生理鹽水。
1.2.2 原蟲率計數 實驗鼠于接種原蟲后瀕死前（6~9 d）采尾血涂片鏡檢，吉姆薩染色后計數 iRBC 數（原蟲率）及觀察瘧原蟲的形態。
1.2.3 小鼠WBC過濾 眼球采血，0.1%肝素抗凝，涂片。血樣立即用NVF濾器過濾或-80oC冰凍保存后過濾。過濾方法為：各微量血樣（<1 mL,0.5~0.8 mL）用RPMI 1640培養基稀釋至5 mL,混勻，取100 mL,用于過濾前用血球計數板對WBC和RBC的直接計數。稀釋血樣純化前，先用10 mL RPMI 1640培養基濕化處理濾器（膜），接著用注射器將稀釋好的血樣緩慢的加入到濾器中：先取6份血樣，分別調整流速為20 滴/min;40 滴/min及100 滴/min各2份，濾器和收集管的高度固定為80 cm,以確定最佳過濾條件；待血樣經過濾器后，分別用約20mlRPMI 1640液沖洗濾器，收集過濾液，將濾過液置離心機3 000 r/min,離心10 min,棄上清，保留5 mL.用移液器在細胞沉淀的上緣吸取混有約50%液體的細胞沉淀10 mL,混勻涂片，染色鏡檢濾后WBC數、瘧原蟲形態及密度?；靹蚱溆嗟募毎麘乙?，從中取100 mL,用于過濾后WBC和RBC的直接計數。WBC清除效果的評價采用對比過濾前后血液中的WBC直接計數及血片鏡檢10個高倍視野（1 000 個紅細胞/ 高倍視野） 中白細胞的平均數目的方法進行，瘧原蟲感染率為iRBC/1 000 個紅細胞×100%.
1.2.4 原蟲血樣DNA提取、PCR擴增 取白細胞濾過后的感染Pb新鮮及凍存鼠血，按照試劑盒說明書提取DNA,對小鼠（宿主）和瘧原蟲GAPDH基因片段分別進行PCR擴增。引物序列如下：小鼠GAPDH: F:5'-ACAGTCAAGGCCGAGAATGGG-3', R:5'-ACGACATACTCAGCACCGGC -3'; PbGAPDH: F: 5'-TAAAGAAGCATCTGAGGGTC-3',R: 5'-ATCATTTAAGGCAAGACCAG-3'.PCR擴增條件： 95℃3 min;95 ℃ 15 s, 57 ℃30 s,72℃30 s, 35個循環；72 ℃10 min.2%瓊脂糖對PCR產物進行電泳后結果分析。
1.3 統計學處理
采用 GraphPad Prism 5.0 統計軟件進行數據分析。多組間比較采用單因素方差分析（one-wayANOVA），兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗或 Mann Whitney test,均用（ X ±s）表示，P<0.05 為差異具有統計學意義。
2 結果
2.1 Pb感染小鼠蟲血NVF濾器過濾流速對過濾效果的影響
分別對流速為20 滴/min;40 滴/min及100 滴/min的去除WBC效果進行比較，血涂片及直接計數WBC去除率沒有差異，99.25%~99.75%;濾過時間<1 min.
2.2 新鮮血樣及凍存血樣的WBC去除效果比較
WBC濾過后的結果A、B、C三組比較，差異無統計學意義（P>0.05）；WBC直接計數和血片鏡檢間接計數結果一致；新鮮血RBC的回收率C組明顯高于A組。差異具有統計學意義（P<0.05）；而B組經-80℃凍存后，發生RBC溶血，見表1.濾過后的血涂片上瘧原蟲密度及形態沒有見到明顯變化，見圖1.瘧原蟲RBC感染率由于RBC的破裂無法準確計數，以半定量表達，與濾過前比較無明顯差異?！緢D1】
2.3 瘧原蟲基因與小鼠基因的表達
取 4 份 Pb 感染小鼠血樣，新鮮與凍存血各 2 份，經 WBC 過濾去除后，其中，經 PbGAPDH引物 PCR 擴增后均出現陽性條帶，而經小鼠 GAPDH 引物 PCR 擴增后結果均為陰性。見圖 2.【圖2】
3 討論
臨床用去白細胞輸血器由多層聚酯纖維無紡布制成。其原理是依靠濾材的篩濾和吸附作用，利用WBC與其他血細胞的直徑差異和通過濾材時變形能力的差異，以及濾材表面對血細胞吸附力的區別使WBC與其他血細胞分開，將血液中的微聚體、WBC滯留在濾材上，而讓血液中的其他成分通過，從而達到去除白細胞預防或減少輸血反應的目的.一次性去白細胞輸血器通常由穿刺器、軟管、過濾件、空袋等組成，容量多為200 mL,臨床應用普遍，而用于去除瘧原蟲血樣中的WBC則是初次嘗試。瘧原蟲血樣不論來自病人或小鼠模型，均具有樣本量小的特點，本實驗所用的鼠瘧標本每份都在1 mL以內，將血樣直接稀釋至5 mL,結果顯示，WBC平均去除率新鮮蟲血標本為（99.90±0.07）%,凍存蟲血標本為（98.38±0.90）%,并未受到血液稀釋、血漿蛋白減少的影響，可以正常有效的濾過；過濾時的樣本流速對WBC的過濾效果亦無明顯影響。
樣本的新鮮與否對WBC的去除效果無明顯影響，但對RBC的回收影響明顯：正常對照組RBC回收率為（93.71±1.74）%,新鮮蟲血組為（78.48±3.87）%,明顯降低；而凍存蟲血則因溶血無法計算。通過染色鏡檢WBC濾過后的血片發現，A組部分、B組瘧原蟲所寄生的RBC幾乎全部消失，涂片中可見較多細胞碎片。通常在iRBC中，由于RBC內瘧原蟲的不斷生長成熟，可造成所寄生的RBC形態改變，由正常的雙凹圓盤形向球型變化，引起面積/體積比值減小， 造成變形能力下降，脆性增加；當RBC通過濾器時，部分變形能力差的RBC易受損破裂；經過低溫保存的蟲血，RBC則更易破裂導致無法計數。Tao等報道的瘧原蟲感染血液的WBC濾過后RBC回收率達到了94.39%~96.66%,遠高于我們的實驗結果；經對比，本文所用血樣的平均原蟲率A組18.33%,B組43.69%,顯著高于文獻所用樣本的原蟲率（15~82/10 000,平均0.29%），由此推測，原蟲率的高低可能是導致RBC回收率降低的直接因素之一，而RBC回收率的高低并不影響后續分子生物學的研究。經濾器過濾前后，瘧原蟲的形態及蟲體密度未發現明顯改變。
PCR技術對可能殘留的宿主WBC進行小鼠GAPDH基因擴增，證明排除了宿主WBC DNA的干擾，可滿足后續進行分子生物學、免疫學研究的要求。
綜上所述，去白細胞輸血器用于瘧原蟲感染血液中WBC的濾過去除，獲得滿意效果。與傳統的CF11纖維素粉末填充柱等方法比效，操作更為簡便;與Plasmodipur濾器（Euro-Diagnostica）方法及磁珠法比較，可以達到同樣甚至更優的WBC去除效果，但成本更低，來源方便。NVF濾器一步法是一種快速簡便純化濃縮瘧原蟲血的實用方法。
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