云香復合胃痛膠囊是浙江省中醫院治療慢性淺表性胃炎\\(CSG\\)、功能性消化不良\\(FD\\)等疾病的一種自制中藥制劑,該藥在臨床上有較好的治療效果,但相關機制尚不清楚。筆者通過建立大鼠CSG模型,檢測大鼠幽門括約肌組織中一氧化氮合酶\\(NOS\\)、乙酰膽堿酯酶\\(AchE\\)的活性來初步探討其對CSG的作用機制?，F報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 動物
清潔級Wistar成年大鼠80只,一級質量標準,雌雄各半,體重\\(230±20\\)g,由浙江中醫藥大學實驗動物中心提供。
1.1.2 藥物與試劑
云香復合胃痛膠囊由云母粉、香附、白芍、延胡索\\(醋制\\)、海螵蛸、甘草6味中藥組成,浙江中醫藥大學附屬第一醫院藥劑科提供;雷尼替丁由福州海王福藥制藥有限公司提供\\(批號:060820\\);水楊酸鈉為上?；瘜W試劑采購供應五聯化工廠生產\\(批號:20040309\\);NOS測定試劑盒:南京生物工程研究所\\(批號:20060728\\);AchE測定試劑盒:南京生物工程研究所\\(批號:20060824\\);考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒:南京生物工程研究所\\(批號:20060820\\)。
1.1.3 實驗儀器
Au2700自動生化分析儀:日本Olympus公司;RM2135病理切片機:德國Leica公司;BX60型顯微鏡:日本Olympus公司;DK-S22型電熱恒溫水浴箱:上海精宏實驗設備有限公司;低溫高速離心機\\(Biofuge28RS\\):上海醫用分析儀器廠。
1.2 實驗方法
1.2.1 動物造模及分組與給藥詳見文獻
1.2.2 檢測指標及方法
取大鼠新鮮幽門部胃組織0.5g,加9倍0.9%氯化鈉4.5ml,手動勻漿,制成10%的組織勻漿液,繼以3000r/min離心10min后,取3ml組織勻漿液放入-80℃冰箱中,待測以下指標:
①幽門括約肌NOS活力的測定:樣本及試劑從冰箱取出,37℃水浴3min,進行下列操作,空白管雙蒸水a*\\(50μl\\);總NOS測定管樣本量a*\\(50μl\\),2管試劑一底物緩沖液,200μl,試劑二促進劑,10μl,試劑三顯色劑,100μl,混勻,37℃水浴準確反應15min,試劑四透明劑100μl,試劑五終止劑2000μl,混勻,530nm處,1cm光徑,蒸餾水調零,測吸光度值。
總NOS活力\\(U/mgprot\\)=總NOS測定管OD值-空白管OD值/呈物色納摩爾消光系數×反應液總體積/取樣量×1/\\(比色光徑×反應時間\\)/蛋白含量\\(mgprot/L\\)。根據以上公式得出總NOS活力=總NOS測定管OD值-空白管OD值/\\(38.3×10-6\\)×\\(2.41+a*\\)/a*×1/\\(1×15\\)/蛋白含量\\(mgprot/L\\)。
②組織AchE活力的測定:取上清液25μl測定AchE活力,操作步驟見表1。
計算公式:組織勻漿中AchE活力\\(U/ml\\)=測定管OD值-對照管OD值/標準管OD值-空白管OD值×標準管濃度×樣本測試前稀釋倍數。
a*為取樣量及補足蒸餾水的量。
1.3 統計學處理方法
采用SPSS11.5forWindows統計軟件對其進行分析,計量資料以x珚±s表示,采用t檢驗。
2 結果
各組大鼠幽門括約肌NOS、AchE活性的比較見表2。
3 討論 在治療CSG中,NO在炎癥過程中具有雙重作用,一方面,內皮源性NO具有抑制炎癥過程的作用;另一方面,炎癥過程后期合成大量NO又可參與炎癥反應,具有細胞毒作用,可以導致胃黏膜損傷。NO的這種細胞毒作用被認為是內毒素所致胃腸道損傷的機制之一。
胃腸蠕動和括約肌收縮主要依靠興奮性神經遞質,如Ach、胃動素和P物質等,其中Ach起主要作用,而胃中Ach水平能反應迷走神經活性,為胃腸動力興奮性遞質,具有刺激胃腸肌收縮和促進胃-腸蠕動的作用,還與胃腸腺分泌有關。幽門括約肌是調節和控制胃-十二指腸的消化運動生理功能的“關口”,有較豐富的內源性神經支配系統\\(ENS\\)直接支配。
Koch等研究發現迷走神經張力喪失和交感神經活性增加引起胃節律紊亂,這可能是CSG導致胃黏膜損傷的機制之一。
本實驗結果表明,實驗性CSG大鼠幽門括約肌組織iNOS表達顯著高于正常組,各治療組iNOS表達明顯低于模型組,其中云香復合胃痛膠囊中劑量組基本接近正常組。這可能是由于:
①慢性炎癥刺激iNOS誘導合成,進而合成大量NO參與胃黏膜局部損傷與炎癥反應;②云香復合胃痛膠囊有直接抑制iNOS生成的作用,或可能通過多種途徑減輕胃黏膜的損傷與炎癥,減少了介導促進iNOS生成的細胞因子,間接抑制了iNOS的合成。
同時,有資料顯示:NOS有拮抗Ach的作用,但不影響Ach的釋放。本實驗研究結果提示實驗性CSG大鼠既存在NOS水平升高,也存在AchE活性的增高;Ach釋放減少引起胃蠕動減慢、排空低下,而NOS水平升高不僅使神經營養障礙和合成Ach減少,而且能引起胃排空紊亂。這可能是云香復合胃痛膠囊治療CSG的機制之一。
