近年來，隨著蛋白質組概念的提出[1]，蛋白質雙向電泳技術越來越受到大家的關注， 該技術尤其是在作物雄性不育研究方面應用較多。 蛋白質組學的關鍵技術是雙向凝膠電泳-質譜分析技術，該技術通過雙向電泳對蛋白質進行分離， 實現對蛋白的定量研究， 后期與質譜鑒定相結合， 實現蛋白的定性分析，最后還可利用數據庫對蛋白進行具體的鑒定，確定蛋白的種類、功能等[2-3]。 因此，結合雙向電泳技術，從蛋白質組水平研究作物雄性不育機理， 尋找與育性相關的蛋白質，進而找到相應的不育基因，對研究作物雄性不育具有重要的理論和實踐意義。

1 蛋白質組學研究方法

蛋白質組學研究的常規方法是提取全蛋白，經雙向電泳分離形成一個蛋白質組的二維圖譜， 通過計算機圖像分析得到各蛋白質的等電點、分子量、表達量等，再用質譜分析進行蛋白質鑒定，建立“正常生理條件下”蛋白質圖譜和數據庫。 在此基礎上，可以比較分析不同條件下的蛋白質組所發生的變化，如蛋白質表達量的變化、翻譯后的加工修飾、蛋白質在亞細胞水平上定位的改變等， 從而發現和鑒定出特定功能的蛋白質及其基因[2，3]。 蛋白質組研究分析通常有 3 個步驟，第一步，運用雙向電泳技術分離樣品中的蛋白質；第二步，應用質譜技術或 N 端測序技術鑒定雙向電泳分離的蛋白質；第三步，應用生物信息學技術儲存、處理比較獲得的數據。

1.1 蛋白質雙向電泳技術

1956 年 ，Smithiea 和 Poulik 發明了雙向電泳 ，1975 年， O'Farrell 對其做了改進， 并建立起了雙向凝膠電泳技術體系[4]，1975 年 Gasparic 等合成了固相pH 介質[5]，通過近 40 年的發展 ，雙向電泳技術已逐步成熟完善，但其基本原理并未改變，即根據蛋白質等電點和分子量的差異，進行雙向電泳，第一向是等電聚焦（isoelectric focusing,IEF）,第二向是聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）, 這樣各個蛋白質根據等電點和分子量的不同而被分離、分布在二維圖譜上，從左到右是等電點的增加，從上到下是分子量的增加。

雙向電泳一次可以分辨出 1 000～2 000 個蛋白質，有些甚至可以分辨出 5 000～10 000 個斑點[6-9]，而且同時獲得該蛋白質的等電點和分子量。 固向化 pH 梯度（Immobilized pH gradient,IPG）的發明和完善，使雙向凝膠電泳的重復性和上樣量得到了改善， 而與雙向凝膠電泳相結合的新型凝膠染色技術， 如熒光染色的開發，使其分辨率大大增加。

1.2 質譜技術

質譜技術是近年來蛋白質組學研究中最重要的技術突破之一，其原理是將樣品分子離子化，根據離子間質荷比（m/z）的差異來分離并確定質量。 質譜測定中首先將通過 2-DE 分離到的蛋白質用特定的蛋白質酶消化成肽段，然后用質譜儀進行分析[2,3]。 基質輔助激光解吸質譜技術 （Matrix-assisted Laser Des-orption Ionization, MALDI） 和電噴霧質譜技術（Elec-trospray Ionization ,ESI）的發明，使得傳統的主要介于小分子物質的有機質譜技術取得了突破性進展。 這兩項技術具有高靈敏度高通量和高質量的檢測范圍等特點，使得在 pmol（10-12）甚至 fmol（10-15）的水平上準確地分析分子量高達幾萬到幾十萬的生物大分子成為可能[2]。

1.3 生物信息學數據庫

由于 Interent、 大型服務器和廣泛的計算機的參與，蛋白質組的研究效率和精確度大大提高[2]。 對蛋白質進行雙向凝膠-質譜分析后，如需最終確定蛋白的種類， 則需要查詢蛋白質數據庫[3]， 目前已有MELANIE、PDGVEST 等軟件，可自動迅速地完成 2-DE 凝膠圖像，進行圖形處理，斑點檢查與量化、背景過濾、2-DE 的匹配與比較，以及統計分析工作。 這些1預測潛在的翻譯后調節方式和三維結構[2,7,9]。 蛋白質數據庫是蛋白質組研究水平和能力的標志。 到目前為止， 與蛋白質有關的數據庫占生物學數據庫總數的半數以上，由此可見，生物信息學與蛋白質組研究關系密切。

2 雙向電泳技術在作物雄性不育研究中的應用

目前， 雙向電泳技術已廣泛應用到作物雄性不育研究中，并找到了一些與育性相關的蛋白。 水稻、小麥、大豆等作物的不育相關蛋白研究表明，不育系與保持系的葉片之間的蛋白質幾乎沒有差異,種子間僅有少量差異，而花藥之間有比較大的差異,說明不育基因表達具有時空性和器官特異性。 即與育性有關的蛋白不在營養器官中表達， 而主要在花藥中表達[10]。

2.1 雙向電泳技術在水稻雄性不育研究中的應用

曹以誠等對光敏核不育水稻花藥蛋白雙向電泳表明， 處于 14 h 長日照下的光敏核不育農墾 58S 二核花粉期蛋白比處于 9 h 短日照育性正常二核花粉期蛋白缺少一組蛋白， 這組蛋白很可能與育性表達有關[11]。 王臺等對光周期敏感核不育水稻葉綠體的特異性蛋白研究發現，無論內外環境如何，農墾 58S 的葉綠體內均有 45kDa 和 61kDa 的特異性蛋白質，而農墾 58 沒有，認為這兩種特異蛋白可能和育性轉換有關[12]。 謝錦云等對溫敏核不育水稻的不育和可育花藥樣品進行雙向電泳分離、 質量指紋圖譜分析及數據庫檢索，在不育到可育圖譜上，明顯上調的蛋白質包括幾丁質酶、酸性磷酸酶、谷蛋白前體等，明顯下調的蛋白有谷氨酸氨甲酞轉移酶等[13]。 文李等對紅蓮型細胞質雄性不育水稻的不育系 （YTA） 和保持系（YT T3）單核花粉總蛋白質進行分離 ，得到 85 個差異表達蛋白質，初步鑒定出 9 個蛋白質點，這些蛋白的缺失或表達量降低可能導致能量供應不足、 淀粉合成受阻，因而花粉不能正常發育[14－15]。

2.2 雙向電泳技術在小麥雄性不育研究中的應用

門淑珍等取小麥“京 411”不育株（Ms2）和可育株處于減數分裂期的花藥進行雙向電泳， 發現不育花藥比可育花藥缺少相對分子量分別為 15.8 ,17 ,17.8,38 ,81. 3 kD 的幾個多肽， 不育系花藥比可育花藥多一個相對分子量為 16.2 kD 的酸性蛋白,其等電點約174.1 kD） 的多肽上， 可育花藥的蛋白斑點濃于不育花， 說明可育花藥中這幾種蛋白的含量高于不育花藥[16]。 范寶莉等在小麥 T 型細胞質雄性不育系與保持系蛋白質雙向電泳比較研究中發現在花粉敗育的關鍵時期一二核小孢子期， 小麥細胞質雄性不育系有53 kD/pI5.5 50 kD/pI 5.7,48 kD/pI 5.6 和 20 kD/pI7.5 共 4 種蛋白組分存在，而保持系中沒有[17]。 劉衛等對遺傳型不育系 ms （S）-西農 1376、 對應的保持系（A）-西農 1376 和生理型 （化學殺雄劑 SQ-1 誘導）雄性不育系 ms （A）-西農 1376 為材料, 利用 IEF/SDS-PAGE 凝膠電泳技術, 對發育到單核后期的花藥全蛋白特異性進行了比較分析, 得到 320～350 個清晰的蛋白點，認為遺傳型和 SQ-1 誘導的生理型不育系蛋白質圖譜與正常保持系在蛋白質（多肽）表達量上存在一定的差異, 同時發現有幾種蛋白質的表達有明顯的特異性, 兩個不育材料 2D 膠上共有幾個明顯的特異蛋白點, 而在保持系中未發現; 兩個不育材料又分別具有自己的特異蛋白表達, 不育機理不同; 不育系中某些蛋白的表達受到了抑制, 并開啟了與花藥敗育有關的特定蛋白的表達[18]。

2.3 雙向電泳技術在大豆雄性不育研究中的應用

曾維英利用蛋白質組學技術對大顯質核互作雄性不育系 NJCMS2A 及其同型保持系 NJCMS2B 花藥進行蛋白質組比較分析, 在二胞花粉期花藥 2-DE 圖譜上分別檢測到約 217、 214 個蛋白點， 兩系間有25 個差異表達蛋白點， 其中 13 個在 NJCMS2A 中表達，而在 NJCMS2B 中缺失，10 個在 NJCMS2A 中缺失而在 NJCMS2B 中表達，2 個在 NJCMS2A 中表達量明顯下調。 在 NJCMS2A 與 NJCMS2B 的單核小孢子期花藥 2-DE 圖譜上分別檢測到約 193、192 個蛋白點，兩 系 間 有 16 個 差 異 表 達 蛋 白 點 ， 其 中 9 個 在NJCMS2A 中 表 達 而 在 NJCMS2B 中 缺 失 ，7 個 在NJCMS2A 中缺失而在 NJCMS2B 中表達[19,20]。

3 存在問題

蛋白質樣品制備的優劣將直接影響 2-DE 結果，是試驗成敗的關鍵步驟之一。 由于植物細胞含有很厚的細胞壁和多種次生代謝物質，因此，蛋白的提取相對比較復雜。 目前常用的蛋白質提取和沉淀方法主要有尿素/硫脈法、TCA/丙酮、醋酸銨沉淀法、酚提取等方法，其中 TCA-丙酮沉淀蛋白是利用雙向電泳技術分離植物蛋白質最常用的方法。 它的優點在于在沉淀蛋白的同時，抑制了蛋白酶的活性，并去除一些干擾物質。 但 2-DE 還是有很多不足之處，它不易檢測出低拷貝的蛋白、極酸或極堿的蛋白質、分子量極大或極小的蛋白質以及難溶的蛋白質， 有時一個蛋白點含有不止一種蛋白，重復性仍然不理想等，需要進一步的改進。

4 展望

蛋白質組研究不僅可以作為現有基因組功能研究的鑒定和補充， 也為不育基因的研究開辟了新的道路。 植物雄性不育的蛋白質組學研究成果說明了雄性不育的育性轉換與某些特異蛋白相關， 包括蛋白質的表達上調、下降、缺失或者一些蛋白的新增，也獲得了一些與雄性不育育性轉換相關的蛋白，并運用質譜分析初步確定了蛋白， 但對這些蛋白在作物雄性不育的育性轉換過程中的作用機理還不清楚，因此，需要與轉錄組研究結果相結合，把蛋白質與基因聯系起來， 能更好地揭示植物雄性不育的分子機理。

參考文獻

[1]Herbert B R, Molloy M P, Gooley A A, et al. Improved proteinsolubility in two -dimensional electrophoresis using tributephosphine as reducing agent [J].Electrophoresis, 1998,19 （5）:845-846.
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