多倍體植物在自然界中普遍存在，目前在農業生產中，主要農作物都是多倍體，如小麥為異源六倍體、棉花和油菜為異源四倍體、甘薯為同源六倍體，而水稻和玉米為二倍體化的古多倍體。多倍化研究已經成為當前進化生物學、遺傳學和基因組學領域的研究熱點[1].

多倍體通過自然加倍獲得，但數量稀少，頻率低，甚至在自然條件下不能正常生長而死亡，難以應用于生產實踐中[2],因此，20 世紀初育種家們開始對人工誘導多倍體進行探索。起初，人工加倍的方法是通過物理的手段獲得多倍體，如高溫、輻射，但誘變率低下，常發生嵌合體[3].1937 年，Blakeslee 等[4]用秋水仙堿加倍曼陀羅等植物的染色體數獲得了成功。秋水仙素被廣泛應用于培育植物新品種。秋水仙素，即秋水仙堿，純秋水仙堿呈黃色針狀結晶，熔點 157℃，易溶于水、乙醇和氯仿，味苦，有毒。秋水仙素通過作用于有絲分裂中期使染色體加倍。其原理是秋水仙素可以與α - 微管蛋白和 β - 微管蛋白形成的二聚體特異性結合，減少了微管二聚體裝配在微管上的數量，結果使微管拆卸的速度大于裝配的速度，最終使形成的微管解聚，染色體加倍但細胞質不分裂，因此染色體數目加倍。

最初秋水仙素誘導多倍體是活體進行。通過適當的操作，如點滴、注射、涂抹等誘導植株的頂芽、腋芽等位置，但活體操作時細胞的分裂不能同步，活體誘導較難得到純合四倍體植株，大多為嵌合體，誘導率低。隨著生物技術的發展，離體誘導多倍體的條件已經十分成熟。離體誘變育種有諸多優勢： 誘導率高； 試驗易于重復進行； 嵌合體發生率低，方便純化； 時效快、操作方便； 節省空間、人力物力； 便于控制室溫、光照等條件等。張蜀寧等[5]利用秋水仙素離體誘導青花菜，得到變異植株 20 株，其中純合植株有 19 株。秋水仙素離體誘導同源多倍體在種質創新和新品種選育上發揮了重要作用，誘導產生的同源多倍體常伴隨植物形態、解剖、生理、栽培特性等方面而改變，如葉片變厚變大、葉色加深、葉綠素含量增加； 花器官、果實變大； 維管束變大、抗逆性增強、生物量或生物有效成分增加等[6].

同源多倍化引起的表型變化及其機理研究亦成為研究熱點[7 -8].

本文總結了近十年秋水仙素離體誘導植物多倍體的研究進展，對影響誘導效率的因素如外植體類型、處理方法及其他因素進行了綜述，并探討了倍性嵌合體的分離方法、同源多倍化效應及其分子機理研究，旨在為從事植物多倍體研究的育種工作者提供參考。

1 秋水仙素離體誘導多倍體技術方法

1. 1 外植體類型的選擇

秋水仙素只能作用于正在進行有絲分裂的細胞，所以，在利用秋水仙素誘導多倍體時，應選擇分裂旺盛的組織作為誘變材料，如莖尖、根尖、幼葉、頂芽等。根據品種的不同選擇適宜的外植體，同一品種，外植體選擇的差異也能造成不同的誘導率。Huang 等[9]和李涵等[10]分別以盾葉薯蕷的愈傷組織和試管苗為材料，誘導率分別為 36. 7%和 50%.Aina 等[11]比較了落花生不同外植體多倍體誘導率的高低，結果表明種子誘導率和存活率均顯著高于莖尖和愈傷組織?？傊?，探索適宜的外植體作為試驗材料，是成功獲得多倍體的有效途徑。外植體的類型繁多，總結近十年部分研究結果匯總如下（ 表 1） .

1. 2 秋水仙素處理濃度、時間與方法

1. 2. 1 處理濃度 研究表明，只有在一定的處理濃度范圍內，秋水仙素才能有效誘導多倍體發生； 隨著濃度的升高，處理過程中外植體的死亡率也逐漸提升，或者在后期培養中，植株生長緩慢、畸形，甚至死亡[11 -60].

余道平等[49]利用秋水仙堿誘導迎陽報春的愈傷組織時發現，秋水仙素處理明顯抑制愈傷組織芽的分化，并且隨著秋水仙素濃度的升高、處理時間的延長，褐化死亡的愈傷組織逐漸增多。不同植物品種、外植體類型和植物生長時期對秋水仙素的敏感度不同。一般認為，誘變處理濃度為半致死率時，可獲得較高的誘導率，所以誘變過程中常常使用對處理材料造成半致死效應的劑量[61].彭靜等[62]探索不同濃度秋水仙素誘導貢蕉多倍體，研究發現，當秋水仙素濃度為 0. 4%,多芽體處理 48 h 時致死率為 45. 83% （ 接近半致死率） ,此時誘導率最高。若使用濃度過高，植株生長受抑制甚至死亡； 濃度過低，則不能獲得純合變異植株。

通常，秋水仙素離體誘導多倍體的處理濃度為 0. 01 ~3. 00 g·L- 1.

1. 2. 2 處理時間 施用濃度一定時，植株的死亡率隨處理時間的延長而升高。處理時間過短，分生組織的有絲分裂不能同步進行，易得嵌合體； 時間過長，誘導材料受秋水仙素毒害過大。低濃度和短時間易產生嵌合體[58],這可能是由于短時間內秋水仙素無法徹底滲入外植體同步加倍所有細胞。處理濃度和處理時間是影響多倍體發生的最重要的 2 個因素，所以應設置合適的濃度梯度和時間梯度，探索最佳的組合。

1. 2. 3 處理方法 浸泡法是目前處理材料最簡便、常用和有效的方法。該方法能使藥液全面接觸外植體，細胞分裂同步程度高，變異穩定，可以減少嵌合體的發生； 但對材料傷害較大，所以處理時間不宜過長?；炫喾ㄊ菍⑼庵搀w在含有不同濃度秋水仙素的固體培養基中誘導產生多倍體，誘導完成后轉入無秋水仙素的培養基中。該方法越來越受人們的關注。Shao等[42]使用混培法和浸泡法誘導石榴多倍體，結果表明，使用混培法誘導多倍體，誘導率達 20%,使用浸泡法沒有獲得多倍體?；炫喾ㄅc浸泡法比較，其優點是：外植體不和藥液直接接觸，所以受傷害??； 藥液消耗量小，可節約成本。由于混培法使用的濃度較小，所以處理時間延長至幾天、十幾天甚至幾十天。王娜等[35]

用混培法誘導酸棗四倍體的時間為 40 d.

處理外植體還可用點滴法。如王波等[40]使用該方法誘導甜葉菊，多倍體誘導率為 42. 3%.但由于該方法獲得嵌合體較多、耗藥量大、操作麻煩，所以逐漸不被采用。不同外植體應采用不同處理方法，掌握適宜的施用濃度、處理時間和操作方法，是誘導多倍體的有效途徑。

1. 3 影響秋水仙素離體誘導多倍體的其它因素

浸漬法結合震蕩等方式處理外植體可使秋水仙素與外植體充分接觸，促進誘變劑發揮效果。韓超等[45]報道了搖床、滲透劑對誘導巨尾桉多倍體的影響，結果表明，既不使用搖床，也不使用滲透劑，在秋水仙素溶液濃度為 0. 5%,處理時間為 96 h 時達最大誘導率41% ; 不使用搖床，但使用滲透劑，在秋水仙素溶液濃度為 0. 3%,處理時間為 48 h 時達最大誘導率 39%;既使用搖床，也使用滲透劑，在秋水仙素溶液濃度0. 2% ,處理時間為 24 h 時達最大誘導率 56% .

誘導中可使用 DMSO（ 即二甲基亞砜） 促進秋水仙素對細胞的滲透。DMSO 是化學滲透劑，使用量一般為 1% ~ 4%,過多則使外植體受 毒 害。Escandón等[38]使用含有 1% DMSO 的秋水仙素處理過長沙舅128 株植株，獲得變異株 68 株。
有些植物的誘導率對基因型有很大的依賴性。

G\ue548owacka 等[43]比較芒草品種 M. sinensis 的 4 個不同基因型（ 即 Ms10、Ms11、Ms16 和 Ms19） 的多倍體誘導效率，基因型為 Ms10 的誘導率最高，為 55%; Ms16 最低，為 18. 4%.同一外植體的不同生長時期，也會造成誘導率的差異。王沖等[50]研究了不同胚齡對誘導君子蘭四倍體的影響，結果表明： 0. 01%秋水仙素處理 180 d 胚齡的未成熟胚 20 d 誘變效果最佳，四倍體誘變率最高，達 30. 8%; 處理 150 d 胚齡誘導率最低。

2 多倍體倍性鑒定

2. 1 形態學鑒定

多倍體呈現"巨大性": 莖干粗壯，葉片寬厚，葉形指數減小，葉色深綠，葉表粗糙，花瓣顏色深邃，花冠、果實碩大等。Muhammad 等[63]從形態學鑒定了 7 個品系的四倍體西瓜，結果表明四倍體西瓜與二倍體西瓜差異顯著。四倍體西瓜有更粗的瓜藤，更大的葉面積，更厚的瓜皮。紫薇四倍體與二倍體相較，花蕾更大，花朵直徑增加，花瓣更長且皺縮，有更好的觀賞價值[64].

2. 2 組織水平鑒定

完整植株是由頂端分生組織發育而來，頂端分生組織由 3 個細胞原層組成。最外層為 LI,中間層為 LⅡ，最內層為 LⅢ[65].LⅠ發育成表皮，LⅡ層發育成花粉，葉片最中心的部位則由 LⅢ衍生的細胞組成[66].所以，檢測植株的表皮、花粉、葉綠體，可以有效確定該植株是否為純合多倍體。多倍體表皮的氣孔的保衛細胞顯著增大，密度減小，保衛細胞中的葉綠體顏色深，數量多； 多倍體花粉粒體積增大，有的呈畸形并伴隨育性降低。Tang 等[48]通過觀察二倍體泡桐和四倍體泡桐的葉表皮，得出結果： 四倍體泡桐氣孔密度比二倍體顯著減小，氣孔增大，氣孔內的葉綠體顯著增多。此外，多倍體有更發達的輸導組織。Graciano-Ribeiro 等[67]通過觀察大量四倍體木薯的橫截面，發現四倍體的髓區較大，有比二倍體更成熟的次生維管組織。

2. 3 染色體計數鑒定染色體計數是分析倍性最直接的方法[48].然而，逐株進行染色體鑒定費時費力[68].一般以根尖、莖尖和幼葉作為鑒定對象。該鑒定方法的缺點是步驟繁瑣，需每株進行解離、染色、制片，并用顯微鏡觀察數出染色體數。這種鑒定方法對試驗條件和操作水準要求較高。

2. 4 流式細胞儀鑒定

流式細胞儀在植物倍性鑒定應用越來越普遍。流式細胞儀能夠快速一次性檢測大量樣品及分析植株中不同組織的倍性[69],而且該方法對鑒定材料要求不高，在植物生長發育的早期即可進行鑒定。其鑒定原理是 DNA 相對含量與倍性水平相關[5],通過測量細胞內 DNA 含量鑒定植株倍性。

3 研究展望

3. 1 秋水仙素替代劑的應用

氟樂靈（ trifluralin） 、氨磺靈（ oryzalin） 和甲基胺草磷（ amiprophosmethyl） 等是除草劑，亦可成為有絲分裂抑制劑。與秋水仙素相比，它們對微管蛋白二聚體的親和性更高，誘變效率更高，且無毒，使用濃度低，可減少經濟成本。Dhooghe 等[70]比較了氟樂靈、秋水仙素和氨磺樂靈對毛茛的誘變效果，誘導率最高的為氟樂靈，27. 5%,其次是秋水仙素處理，23. 3%,最次為氨磺靈。Kermani 等[71]用氨磺靈誘導玫瑰，四倍體變異率最高為 66%.除了施用一種抗裂劑外，還可以采用混合抗裂劑誘導多倍體。李秀蘭等[72]使用低濃度的混合抗裂劑（ 0. 01%秋水仙素 + 5 mg·L- 1氨磺靈） 處理秋石斛原球莖 8 ~10d,四倍體誘變率達 90% 以上，沒有發現嵌合體。因此，上述幾種除草劑在多倍體誘導上具有廣闊的應用前景。

3. 2 倍性嵌合體的分離策略

秋水仙素離體誘導多倍體需要建立一套高效的技術方法。誘變材料一般為多細胞組織，如種子、離體胚、組培苗葉片、愈傷組織、叢生芽、單芽莖段等，獲得的突變體多呈倍性嵌合體，一般需要采用較長時間對嵌合體進行分離。植物嵌合體是指在一株植株中，存在 2 種或 2 種以上的倍性水平。嵌合體植株不能穩定遺傳，因此需要對倍性嵌合體進行分離。絕大多數研究報道中只提及嵌合體分離問題，但是未采用有效方法深入系統研究倍性嵌合體分離策略。在離體條件下，嵌合體的分離可及時進行[35].

就無性繁殖作物而言，嵌合體分離通常采用 2 種方式： 組織連續切割分離法和葉片不定芽再生技術[73].李林光等[50]利用葉片離體再生技術，從獲得的蘋果組培苗嵌合體中分離出同質多倍體。王娜等[35]利用組織連續切割分離法對冬棗和酸棗嵌合體進行 3 ~4 次的繼代分離，獲得了同質多倍體，有效防止了回復突變。秋水仙素離體誘導積雪草組培苗獲得的倍性嵌合體經過不同代數培養逐漸分離出來[25].

Roux 等[74]采用不同繼代方式對香蕉組培苗倍性嵌合體進行分離，結合流式細胞儀對不同代數組培苗倍性分離情況進行監測，研究結果表明香蕉組培苗倍性嵌合體采用一定繼代方式可進行有效分離。Cieslak等[75]研究表明，香蕉嵌合突變體經過 6 代連續切割繼代培養可獲得突變純系。組織切割連續培養法是目前有效分離嵌合體的方法，但還需尋找分離嵌合體更有效的方法，探索原倍性細胞與多倍性細胞的競爭機制以及嵌合體回復突變規律，為能及時純化植株倍性提供堅實的理論依據。

嵌合體的發生是多倍體育種工作中的一個難題，從單細胞水平誘導純合多倍體可有效減少嵌合體產生。此時使用的外植體為細胞懸浮液、由單細胞起源的胚狀體或愈傷組織。Dutt 等[55]通過秋水仙素誘導椏柑原生質體，結合原生質體培養技術獲得了柑橘的同質多倍體，沒有嵌合體產生。Zeng 等[54]通過誘導柑橘愈傷組織獲得了四倍體植株。Yang 等[52]處理葡萄體細胞胚獲得了純合四倍體，無嵌合體。嵌合體純化費時費力，大大減慢了多倍體育種速度[76],所以采用分裂旺盛的愈傷組織或懸浮培養的單細胞為誘變材料，能大大提高多倍體純合體的比率[77].

3. 3 同源多倍化效應及其在植物育種上的應用

大量研究結果表明，秋水仙素誘導產生的同源多倍體常伴隨植物形態、解剖、生理、栽培特性等方面改變，如葉片變厚變大、葉色加深、葉綠素含量增加、花器官，果實變大、維管束變大、抗逆性增強[5],同時由于基因劑量的增加，某些營養成分或次生代謝產物含量也明顯增多[78],因此該特點也被廣泛應用于培育植物新品種。黃金艷等[79]對二倍體甜瓜及其誘導出的同源四倍體甜瓜進行維生素 C 含量的比較，發現四倍體比二倍體高 31. 58%.十六倍體的半夏類原球莖的生物堿含量是八倍體的 1. 8 倍[26].Thong-on 等[80]的研究表明四倍體積雪草不僅相較二倍體有更高的生物產量、干物質含量，且富含極具價值的三萜類化合物。多倍體菜用枸杞品種天精 3 號染色體倍性優勢強大，不僅超高產，而且藥用品質、營養品質優良，兼具優良的抗病性[81].

大多數果樹多倍體表現強于其親本的性狀，如植株強壯、生長旺盛、花大果大、抗逆性強等特性[76]; 多倍體新桑品種不但桑葉產量和質量高，且產果量高，光合性能增強[82]; 紫錐菊四倍體與對照二倍體相比，氣孔、花粉、花和種子更大，菊苣酸、綠原酸含量明顯增加[83]; 小天藍繡球（ Phlox drummondii Hook） 四倍體葉片更大更厚、光合速率明顯增加[84]; Sree Harsha 三倍體木薯株系在株型、塊根產量、淀粉含量、適應性上表現出突出優勢，于1996 年在印度作為品種審定[85]; 木薯四倍體新品種具有抗葉斑病、長勢旺、桿粗、結薯集中、早熟等特點，比對照品種6068 增產30% ~60%[86].

3. 4 同源多倍化效應分子機理研究多倍體基因表達研究相當活躍并取得了巨大成就[1].異源多倍體中的研究表明，多倍體不僅導致植物基因組大小以及結構發生改變，還影響了基因的表達模式，如 DNA 甲基化模式的改變也出現在多倍化的過程中。與異源多倍體相比，同源多倍體中基因組及基因表達的研究相對滯后[8].

同源加倍后可能引起基因組大小及結構發生改變，沙田柚同源四倍體發生了較多的基因組 DNA 位點變異，柑橘同源四倍體相對于二倍體親本也出現了較大的位點增加或缺少[87].加倍后導致多倍體中基因表達上調或下降的現象比較普遍[8,88 -89],加倍后在不改變基因序列的情況下常會發生 DNA 甲基化等表觀遺傳改變[90 -91],同源多倍體與親本在蛋白質表達上也可能存在差異[92 -93].同源加倍對基因組及基因表達變化有多大程度的影響，同源加倍引起的表型變化與基因表達相關性有多大，這些表達基因如何影響表型變化，同源加倍引起表型怎樣變化等的機理研究還有很多空白，有待進一步的研究。