煙草BY2細胞\\(Bright Yellow2,BY2\\)是非常重要且用途廣泛的細胞系.由Kato等于1972年分離得到.此外,BY2細胞系具有高度的同一性,生長迅速,可獲得具高度同周期性的BY2細胞,1周內便可增加80~100倍.因此,BY2細胞已是生物研究的模式系統.
目前對于BY2細胞的有效利用大多局限于生化物質對其生長的影響以及利用此模式系統進行煙草細胞一些代謝物質的研究及生產,而鮮有將外源基因轉入BY2細胞并進行研究,本文通過以煙草細胞的外源基因p35S啟動子和綠色熒光蛋白\\(GFP\\)為例,介紹一種快速簡便的將外源基因轉入液體懸浮培養的煙草細胞的方法.
1 材料與方法
1.1 材料
實驗室自有液體懸浮培養煙草BY2細胞,27℃,130r·min-1,暗培養.
p35S:GFP表達載體為實驗室自有表達載體,已通過基因測序和酶切驗證.
1.2 培養基和試劑
1.2.1 煙草BY2細胞培養基 液體:MS鹽,100mg·L-1;肌醇1mg·L-1;鹽酸硫胺素200mg·L-1;磷酸二氫鉀0.2mg·L-1;2,4-D 2mg·L-1;甘氨酸30g·L-1;蔗糖;30g·L-1,pH值為5.8,120℃高溫高壓滅菌20min后使用.固體:在液體懸浮培養煙草BY2細胞培養基的基礎上加入瓊脂粉,使其濃度為1%,120 ℃高溫高壓滅菌20min后使用.
1.2.2 試劑 1mL10mM MgSO4,200mM As.
2 方法
2.1 p35S:GFP表達載體轉入農桿菌 將實驗室自有p35S:GFP表達載體采用熱激轉化的方法轉入農桿菌GV3101,農桿菌GV3101感受態為實驗室自有,并對農桿菌陽性克隆進行陽性克隆的篩選和鑒定.轉化方法詳見參考文獻.
2.2 p35S:GFP表達載體轉入BY2細胞
2.2.1 p35S:GFP表達載體轉入液體培養的BY2細胞
a.將鑒定正確已經轉入p35S:GFP表達載的農桿菌GV3101陽性克隆進行劃板并挑取單克隆進行小型搖培\\(4mL\\),為進行轉基因操作做準備.
b.從小型搖培的農桿菌菌夜吸取100微升于加有硫酸卡那霉素、利福平、慶大3種抗生素的2mL LB培養基中,250r·min-1,28℃過夜直至OD600至0.6.
c.洗農桿菌:取1mL農桿菌菌液于室溫條件下2 500g離心10min,棄上清,加入1mL 10mM Mg-SO4,用移液器吸打混勻,室溫2 500g離心10min,棄上清,加入1mL 10mM MgSO4,用移液器吸打混勻,加入2μL 200mMAs用移液器吸打混勻\\(利于轉化,也可選擇不加\\),靜置2h,室溫.
d.分裝懸浮培養的煙草BY2細胞5mL于4個高溫高壓滅菌的培養皿中,用移液器吹打30次,以誘導缺口,有利于基因轉化效率的提高\\(同時做幾個平行實驗以防染菌\\).
e.在3個培養皿中加入100μL處理好的農桿菌并輕輕搖勻,在另一個培養皿中加入100μL升ddH2O作為對照組.
f.28℃靜置,暗培養48h.
2.2.2 將轉基因的BY2細胞轉入固體培養基
a.在4個培養皿中各加入5mL液體培養基并輕輕搖勻.
b.轉入50mLEP管,用液體培養基補充到總體積為35mL.
c.室溫1 000g離心5min.
d.小心棄去上清,均勻倒在含有50μg·mL-1潮霉素和萬古霉素的固體培養基平板上.
e.28℃靜置暗培養3周.
2.2.3 陽性克隆細胞團的篩選
轉基因BY2細胞轉化后約3周可在50μg·mL-1的潮霉素和萬古霉素抗性平板上長出陽性單克隆的細胞團,萬古霉素可起到抑制農桿菌生長的作用,而潮霉素可起到篩選陽性克隆細胞的作用.將所篩選到的陽性單克隆細胞團轉移出至新的含有50μg·mL-1的潮霉素抗性平板上傳接一代再轉接至液體培養基傳代培養.如圖1所示:【圖1】
3 結果
3.1 熒光觀察
通過激光共聚焦熒光顯微鏡對非轉基因即野生型\\(WT\\)BY2細胞和轉基因型BY2細胞的熒光觀察發現,野生型即非轉基因BY2細胞有著極其微弱的自發熒光,幾乎看不到,但是轉基因BY2細胞的熒光要很強,且遠遠強于野生型BY2細胞\\(圖2\\).【圖2.略】
3.2 RT-PCR鑒定表達載體的表達情況
對轉基因BY2細胞和非轉基因BY2細胞進行RNA提取并進行發轉錄,經過RT-PCR鑒定,結果證明非轉基因BY2細胞即野生型BY2細胞中并無GFP的表達,而轉基因BY2細胞中表達很強\\(圖3\\).【圖3.略】
4 討論
液體懸浮培養煙草細胞系培養操作簡單,傳代培養接種方便快捷,可在4~5d傳接培養一次,這給實驗帶來了極大的方便,有效的的縮短了實驗材料的培養時間,使實驗周期大大縮短.另外近些年在轉基因植物中要提高外源基因的表達效率是一項比較復雜的工作,而在煙草這種模式植物中,轉基因的效率是相對穩定的,液體懸浮培養的BY2細胞生命周期短,轉接傳代操作簡單,可隨時取材進行觀察,省去植物種植的時間.
本文通過以p35S:GFP表達載體轉入BY2細胞為例證明了本方法可以將煙草細胞的外源基因轉化進入液體懸浮培養的BY2細胞,并得到穩定表達.隨著現代分子生物學和基因工程技術的發展,更多有用的基因被克隆和鑒定,目前存在許多轉化率低,轉化植株后代遺傳不穩定等問題.煙草懸浮細胞轉基因手段縮短實驗周期,提高了材料的獲得率和篩選效率.通過我們對實驗方法作出的一些改進,相信此方法將使液體懸浮培養煙草細胞系的利用得到大大的提高,使液體懸浮培養煙草細胞系的應用性更廣,前景可觀.
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