引言

【研究意義】肌肉生長抑制素（Myostatin，MSTN）是一種在肌細胞生成過程中能抑制骨骼肌生長和發育的負向調控因子，通過調控成肌細胞的增殖來影響肌肉的生長與發育；此外，MSTN對脂肪沉積和骨骼的生長發育也有調節作用，甚至還能影響肌腱和韌帶的強硬度（任磊，2007；岳敏，2008；張柯，2010）。因此，深入了解MSTN在豬肌肉生長發育和脂肪沉積方面的功能，揭示動物生長發育機理，對通過調節MSTN基因表達來調控畜禽肌肉生長發育和脂肪沉積，以達到調控畜禽肉品質、機體膘情等具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】MSTN是McPherron等（1997）在研究TGF-β超家族基因時所發現的。發展至今，已分別從豬（Ma et al.，1997）、牛（冀德君等，2008）、羊（李銳等，2010）、大黃魚（Pan et al.，2007）等動物中克隆獲得MSTN基因。國內有關豬MSTN基因的研究也有大量報道。王世凱等（2007）克隆獲得廣西巴馬小型豬MSTN基因cDNA序列長度為1128 bp，其與GenBank報道的豬MSTN基因cDNA序列同源性高達99.7%，共有3處存在堿基突變（兩個為同義突變，一個為錯義突變）。任磊（2007）利用PCR-SSCP分析藏豬MSTN基因3個外顯子的多態性，并利用計算機網絡技術和生物信息學方法比較分析藏豬MSTN基因編碼區序列特點，其結論為合理利用藏豬的優良遺傳資源提供了理論依據。岳敏（2008）通過研究西藏小型豬MSTN基因多態性及其生長發育特性，發現西藏小型豬MSTN基因表現出3種基因型TT、AA和TA，等位基因T和A的頻率分別為23.81%和76.19%。邢慧君等（2012）研究表明，魯萊黑豬MSTN基因5'調控區的435、447和879位點存在多態性，檢測到435A-447G-879T（A）、435G-447A-879T（B）、435A-447A-879A（C）和435A-447A- 879T（D）4種單倍型，依據其遺傳效應，提高B和A單倍型頻率有望提高魯萊黑豬的生長速度，而提高C單倍型頻率可保持魯萊黑豬的優質和高繁特性。劉曉琴等（2013）對長白豬、大白豬、杜長大、通城豬、萊蕪豬、五指山豬的MSTN基因進行多態性檢測及生長性狀關聯分析，發現MSTN基因P4和P5兩個位點的多態性與豬生長性狀顯著相關?！颈狙芯壳腥朦c】陸川豬是中國八大地方優良豬種之一，也是廣西具有地方特色的畜禽品種，因其具有肉質細嫩多汁、香味濃郁等特點而廣受消費者青睞（謝棟光和丘立天，2003；黃雅瓊等，2013）。目前，國內已有一些學者對陸川豬的肉質性狀等表觀指標進行了初步探索（張家富等，2010；何若鋼等，2011），但鮮見從分子生物學角度對陸川豬優良肉質性狀形成的機制進行探討?！緮M解決的關鍵問題】通過克隆陸川豬MSTN基因，分析堿基突變等變化情況，為后期開展MSTN基因表達與陸川豬肌肉生長發育及脂肪沉積的相關性研究奠定基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

試驗用豬為6月齡的廣西陸川豬，由廣西畜牧研究所種豬場提供，宰殺后采集其背最長肌的肌肉組織。Trizol試劑購自天根生化科技（北京）有限公司；酵母浸出物、胰蛋白胨購自英國OXOID公司；感受態細菌購自北京全式金生物技術有限公司；DNA Marker購自廣州東盛生物科技有限公司；質粒抽提試劑盒、DNA片段回收純化試劑盒購自BioFlux公司；M-MLV反 轉 錄 酶 、Taq DNA 聚 合 酶 、pMD18-T 載 體 購 自TaKaRa公司。

1. 2 引物設計與合成

參考GenBank中已發表的豬MSTN基因序列（NM_214435），利用Oligo 6.0軟件設計1對特異性引物，上游序列：5'-ATGCAAAAACTGCAAATCTATG-3'；下游序列：5'-TCATGAGCACCCACAGC-3'，擴增片段大小約1128 bp。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1. 3 總RNA提取

采用傳統Trizol法提取廣西陸川豬肌肉組織總RNA，利用分光光度計檢測RNA純度，電泳檢測RNA完整性。用TaKaRa公司的反轉錄試劑盒對總RNA進行反轉錄合成cDNA。反轉錄體系為20.0 μL，其中總RNA 3.0 μL，5×PrimeScript Buffer 4.0 μL，dNTPs（10mmol/L）2.0 μL，RNA 酶抑制劑 0.5 μL，Oligo（dT）18（2.5 μmol/L）1.0 μL，M-MLV反轉錄酶1.0 μL，DEPCddH2O 8.5 μL。 反應程序為：42 ℃ 30 min，95 ℃ 5mim，5 ℃ 5 min。然后將轉錄產物置于-20 ℃冰箱中保存備用。

1. 4 RT-PCR擴增

以反轉錄產物為模板進行PCR擴增，反應體系為20.0 μL，即模板4.0 μL，10×PCR Buffer 2.0 μL，dNTP（2.5 mmol/L）1.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，TaqDNA聚合酶0.5 μL，ddH2O補足至20.0 μL。反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃100 s，進行35個循環；最后72 ℃延伸5 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1. 5 克隆及序列分析

RT-PCR擴增產物純化回收后與pMD18-T載體連接，然后轉化DH5α感受態細胞，再將菌液涂布在含有氨芐青霉素（Amp+）的LB固體培養基上，37 ℃培養，待菌液完全吸收后（約30 min），將培養基倒置，培養過夜，次日觀察細菌生長情況。挑取單克隆在含Amp+的LB液體培養基中培養，然后利用Cracking鑒定，并用普通質粒小提試劑盒提取重組質粒，將含有目的片段的重組質粒送至北京六合華大基因科技股份有限公司廣州分公司進行測序。測序結果用Lasergene 7.0軟件進行序列分析，用MEGA 6.0軟件進行同源性比對，并用在線蛋白質結構分析軟件Protein Model Portal（PMP）預測陸川豬MSTN蛋白質二級結構。

2 結果與分析

2. 1 陸川豬MSTN基因克隆

提取陸川豬背最長肌總RNA并反轉錄成cDNA，應用設計的特異性引物，經RT-PCR擴增獲得特異性條帶，片段大小在1000~2000 bp（圖1），與預期序列長度1128 bp相近，條帶清晰。

2. 2 陸川豬MSTN基因序列分析結果

陸川豬MSTN基因陽性克隆經測序得到1128 bp的核苷酸序列。該核苷酸序列與GenBank已公布的普通豬（NM_214435）MSTN基因編碼區序列（CDS）的同源性為99.8%，與外來品種約克夏（Yorkshire，AF188638）、漢普夏（Hampshire，AF188636）、杜洛克（Duroc，AF188635）的同源性均為99.9%；與地方品種梅山豬（AF188637）、藏豬（EF612791）、廣西巴馬小型豬（JN630464）的同源性分別為99.9%、99.8%和99.8%。

序列對比分析結果表明，陸川豬MSTN基因CDS與其他品種豬相比，存在第294位點的A→G（圖2），堿基G為陸川豬所特有，但堿基突變未引起氨基酸改變。此外，與普通豬（NM_214435.2）相比，陸川豬MSTN基因CDS還存在第920位點G→A，為錯義突變，導致絲氨酸突變為天冬氨酸；與廣西巴馬小型豬相比，陸川豬MSTN基因第39位點發生C→T，為無義突變；與藏豬相比，陸川豬MSTN基因第71位點發生C→A，導致蘇氨酸突變為天冬氨酸?！緢D1-2】


2. 3 MSTN基因系統進化樹構建

將獲得的陸川豬MSTN基因序列進行BLAST分析，結果顯示，該序列與約克夏豬（Yorkshire，AF188638）、馬（Equus caballus，NM_001081817）、人（Homo sapiens，NM_005259）、食蟹猴（Macaca fascicularis myostatin，NM_001287623）、綿羊（Ovis aries，NM_001009428）、牦牛（Bos grunniens，EU926669）、狐貍（Vulpes lagopus，FJ966249）和小鼠（Mus musculus，NM_010834）的同源性分別為99.9%、97.1%、95.7%、95.7%、94.6%、94.1%、92.3%和91.9%。根據上述物種MSTN基因的堿基同源性構建物種系統進化樹（圖3），發現廣西陸川豬與約克夏豬的遺傳距離最近?！緢D3】

2.4 陸川豬MSTN蛋白二級結構預測結果

利用在線蛋白質結構分析軟件Protein ModelPorta（lPMP）預測陸川豬MSTN蛋白質二級結構，結果如圖4所示，陸川豬的MSTN成熟肽包含有α螺旋、β轉角、延長線和無規卷曲4種二級結構元件?！緢D4】


3 討論

MSTN對動物骨骼肌生長具有重要的調節作用（Lee and McPherron，1999），能夠負向調控肌細胞的生長發育。近年來，MSTN基因在畜禽肉質方面的研究取得了一定進展，被認為是影響畜禽肉質性狀的主要候選基因之一。Grobet等（1997）研究發現，牛MSTN基因發生突變會引起“雙肌”特征，即肌肉過度肥大或肌肉纖維數量增加。張珂（2010）研究表明，MSTN基因可作為影響家兔部分屠體性狀的候選基因，其外顯子1的194 bp和外顯子2的445 bp堿基突變可能是兔屠體性狀（全凈膛重、屠宰率和熟肉率）輔助選擇的遺傳標記。在深入了解MSTN基因對肌肉生長發育負調控作用的基礎上，科學家們期望通過阻斷MSTN基因在體內表達來改善肌肉的生長發育，為畜禽育種開辟新途徑。

本研究克隆的陸川豬MSTN基因CDS與約克夏、漢普夏、杜洛克、梅山豬、藏豬、廣西巴馬小型豬的基因同源性均在99.8%以上，說明豬MSTN基因高度保守，在調控豬遺傳性狀穩定性方面起重要作用。此外，本研究發現陸川豬MSTN基因第294位點存在特有的堿基G，該突變未引起氨基酸改變，但是否影響基因表達有待進一步探究。從基于MSTN基因堿基同源性構建的物種系統進化樹可以看出，兩個品種豬聚為一支，人與食蟹猴聚為一支，即進化樹的拓撲結構與物種之間的遺傳關系相符。豬的MSTN蛋白是由375個氨基酸殘基組成，其中1~23為信號肽，24~266為前肽，267~375為成熟肽（姜聲旺等，2012）。本研究利用PMP軟件預測陸川豬的MSTN成熟肽為270~375位氨基酸，且包含4種標準的蛋白質二級結構元件。序列分析結果表明，不同品種豬的MSTN成熟肽區未發現氨基酸差異，進一步證實MSTN基因比較保守。

可見，MSTN基因可作為研究陸川豬肌肉生長發育和脂肪沉積的候選基因之一，弄清MSTN基因序列對深入了解陸川豬優良肉質性狀形成的分子機制具有重要意義，也可為今后研究MSTN基因在陸川豬骨骼肌中的表達規律及其與肌肉生長發育、脂肪沉積的相關性等奠定基礎。

4 結論

本研究克隆的陸川豬MSTN基因CDS與約克夏、漢普夏、杜洛克、梅山豬、藏豬、廣西巴馬小型豬的基因同源性均在99.8%以上，雖然陸川豬MSTN基因第294位點存在特有的堿基G，但未引起氨基酸改變?？梢?，豬MSTN基因高度保守，可作為研究陸川豬肌肉生長發育和脂肪沉積的候選基因之一。