內皮素－1\\(endothelin－1，ET－1\\)是心血管系統中ET的主要形式，可由內皮細胞、血管平滑肌細胞、心肌細胞、肝細胞和星形膠質細胞等合成。ET－1在心律失常、慢性心力衰竭、動脈粥樣硬化等多種心血管疾病發病中都起著重要作用。氧自由基是機體內氧分子的不完全代謝產物，在缺血、缺氧等應激刺激下，可導致氧自由基生成過多或清除能力減弱，體內積累過多的氧自由基可對體內大分子物質產生毒害，直接或間接導致心血管疾病的發生。此前我們已報道超氧化物歧化酶\\(superoxidedismutase－1，SOD－1\\)能明顯減輕ET－1引起大鼠心律失常，本實驗應用電子自旋共振\\(ESR\\)方法經大鼠檢測冠狀動脈口注射外源性ET－1后對大鼠心肌氧自由基含量的影響，以明確ET－1能否引起大鼠心肌自由基含量的增高。
1、材料與方法
1．1實驗材料
1．1．1動物Sprague－Dawley大鼠30只，雄性，體重\\(200±20\\)g，由北京大學醫學部實驗動物中心提供。
1．1．2儀器E－200電子自旋共振儀\\(X波段，德國Brucker公司\\)。
1．1．3試劑ET－1\\(日本大阪肽研究所公司\\);超氧化物歧化酶\\(SOD－1，南京建成生物公司\\)。
1．2實驗方法
1．2．1分組30只雄性SD大鼠，隨機分為3組，每組10只。ET－1組:冠狀動脈口注射1．5μmol·L－1的ET－1900pmol·kg－1;SOD－1+ET－1組:冠狀動脈口注射SOD－10．6mg·kg－14min后，再注射1．5μmol·L－1的ET－1900pmol·kg－1\\(各組大鼠ET－1的注射劑量均為0．6mL·kg－1\\);對照組:冠狀動脈口注射生理鹽水0．6mL·kg－1。
1．2．2冠狀動脈口注射［6］大鼠用20%尿酯6mL·kg－1腹腔注射麻醉，仰臥位固定，氣管插管，分離右側頸總動脈。然后經右頸總動脈插管，管尖端開口達冠狀動脈口，術后作冠狀動脈口定位，插管末端距冠狀動脈口0．5mm為正確位置，沿此管注射藥物，見圖1。
1．2．3心肌標本冠狀動脈口注射ET－110min后立即開胸取左心室心肌約300mg剪成細條，裝入內徑4mm的塑料管中，填長3cm放置液氮在10min內ESR檢測。自心肌取材至放入液氮凍藏時間平均為15s。
1．2．4ESR測試ESR用E－200波譜儀測試。
先將樣品放入諧振腔，溫度調至100K，待溫度平衡后記錄ESR波譜。測試條件:X－波段，微波功率分別為5、10、20mW，微波頻率9.172GHz，100kHz高頻調制，調制幅度2．5G，濾波時間常數0．128s，掃場寬度500G。各信號峰g值計算:g=νh/βH=0．714484×ν/H\\(ν:微波頻率;h:普朗圖常數;H:磁場強度;β:玻爾磁子\\)。
1．2．5ESR譜分析采用兩種方法，一是取各組O峰絕對幅度作比較，二是取各組O/S比值，O、S波均取波峰至后波谷絕對幅度表示。
1．3統計學方法
用SPSS11．0統計軟件進行分析。實驗數據均以\\(x珋±s\\)表示，數據處理采用組間單因素方差分析法比較，P≤0．05為差異有統計學意義。
2、結果
2．1各組大鼠心肌ESR波譜各組ESR波譜
自左向右主要由O、S、T三個波峰組成，經計算其中S峰g值為2．008，T峰g值為1．937，分別與半醌自由基及過渡金屬離子的g值相近。因此，S峰可認為是半醌自由基信號，T峰為過渡金屬離子信號，O峰g值為2．024與氧中心自由基g值相似，O峰為氧自由基信號，見圖2。各組測量值見表1。從表中可看出，①O峰:ET－1組心肌氧自由基O峰明顯高于對照組及SOD－1+ET－1組\\(P＜0．05\\)，而SOD－1+ET－1組與對照組比較差異無統計學意義\\(P＞0.05\\);②O/S比值:ET－1組與對照組及SOD－1+ET－1組相比，差異有統計學意義\\(P＜0．05\\)。表明冠狀動脈口注射ET－1后，大鼠心肌氧自由基含量明顯增多，提示有激發自由基釋放作用，同時也進一步證明SOD－1具有清除氧自由基的作用。
2．2ET－1組大鼠心肌在不同微波
頻率下的ESR波譜改變微波功率對O峰和S峰幅度的影響結果見圖3。O峰的飽和功率遠大于S峰的，這一現象與氧自由基ESR信號的飽和功率高和半醌自由基ESR信號飽和功率低相一致，進一步證明本實驗所獲及的O峰可能代表活性氧自由基。
3、討論
自由基是指那些最外電子層具有不成對電子的分子、原子、離子和基團。自由基一般反應性較強，因而其壽命一般較短，如氧自由基。但也有少數自由基，反應性并不強，壽命也較長，在通常環境中具有一定的穩定性，如醌類自由基，這些自由基常被用做自旋標記物。氧自由基具有順磁性和很高的反應活性，其測定方法主要有電子自旋共振法、比色法和電化學法等。
ESR又稱電子順磁共振\\(electronparamagnet-icresonance，EPR\\)，是研究電子自旋能級躍遷的一門學科，主要用來研究具有未成對電子結構的自由基、原子、分子\\(包括三線態分子\\)，且不會對自由基產生破壞作用，是檢測順磁性、相對穩定的自由基最直接最有效的方法。
本實驗采用ESR方法檢測了心肌自由基含量，給大鼠冠狀動脈口注射ET－1后，O峰明顯上升降，而相應半醌自由基的S峰基本保持不變，即代表氧自由基含量的O峰與O/S比值增大，明顯高于對照組，表明ET－1有激發心肌細胞產生氧自由基作用。為了進一步證實上述實驗中所得ESR波譜中相應O峰是氧自由基，我們使用了超氧陰離子特異清除劑SOD。超氧陰離子自由基在SOD的作用下生成H2O2，H2O2又在過氧化氫酶的作用下最終生成對人體無害的物質———H2O和O2，從而徹底清除超氧陰離子自由基。本實驗結果表明SOD－1+ET－1組的O峰降低、O/S比值下降，均明顯低于ET－1組，說明注入SOD后氧自由基成分\\(含量\\)減少。外源性ET－1可以降低SOD活性，從而導致心肌氧自由由基升高，其具體機制尚需進一步研究。
參考文獻:
［1］ Yanag Sawa M，Kurihara H，Kimura S，et al． A novelpotent constrictor peptide produced by vascular endo-thelial cell ［J］． Nature，1988，322\\( 31\\) : 411 － 415．
［2］ 劉鎮，曾紀斌，古春花，等． 高血壓患者脈壓差變化與 CRP、ET －1 的相關性［J］． 臨床醫學工程，2012，19\\( 8\\) : 1280 － 1281．
［3］ Ren AJ，Yan XH，Lu Hong，et al． Antagonism of in-hibits hypoxia － induced apoptosis in cardiomyocytes［J］． Can J Physiol Pharmacol，2008，86: 536 －540．
［4］ 蔡志福，陳銘伍，冼磊． 氧自由基與心肌保護［J］． 廣西醫學，2010，32\\( 2\\) : 226 －228．
［5］ 袁文俊，戎偉芳，嚴云，等． 超氧化物歧化酶拮抗內皮素所致大鼠和貓的心律失常［J］． 第二軍醫大學學報，1996，17\\( 6\\) : 539 －541．
［6］ 袁文俊，許金廉，蔣應明，等． 大鼠冠狀動脈口注射定位 方 法［J］． 第 二 軍 醫 大 學 學 報，1995，16\\( 6\\) : 569．
［7］ 趙保路． 電子自旋共振技術在生物和醫學中的應用［M］． 合 肥: 中 國 科 學 技 術 大 學 出 版 社，2009:21 － 25．
［8］ Pan YM，Zhang XP，Zhu JC，et al． Separation and ac-tivity of antioxidant components from polygonum cuspi-datum［J］． Fine Chem，2005，22\\( 11\\) : 835 － 837．
［9］ Guo YL，Li C，OU LC，et al． Analysis and studies onthe capability of resistance to oxidation of phyllanthusemblica L［J］． Journal Honghe University ，2004，2\\( 6\\) : 10 －14．
［10］ Zhao Baolu． Applications of electron spin resonance inbiology and medicine［J］． Chinese Journal of Mag-netic Resonance，2010，27\\( 1\\) : 51 － 64．
［11］ Ren AJ，Yuan X，Lin L，et al． Effects of endothelin －11 － 31 on cell viabililty and ［Ca2 +］\\( i\\) in culturedneonatal rat cardiomyocytes［J］． Physiol Res，2008，57: 373 － 378．
