咯菌腈\\(Fludioxonil\\) 是一種新型的非內吸性苯基吡咯類殺菌劑,為假單胞菌屬的不同種產生的次生代謝物硝吡咯菌素的類似物\\(楊玉柱,2007\\).對子囊菌、擔子菌、半知菌等病原菌引起的病害有非常好的防治效果\\(張曉光,2013\\),且比天然產物硝吡咯菌素抗光解,能專一性地抑制霉菌而廣泛地應用于防治農業生產中的真菌性病害 \\( 楊玉柱,2007\\).成為全球銷量最好的種子處理劑之一,被大量的在農業生產中使用.而咯菌腈的施用可能通過滲透、遷移等途徑進入到土壤和水體中,對土壤和水環境污染可能造成污染.目前對咯菌腈的生物毒性研究少見報道.本文以水生生物溞、藻和陸生生物蚯蚓對其毒性進行研究,以評價其可能對環境造成的潛在風險.
1 材料與方法
1. 1 試驗生物
大型溞:為純品系生物株,引自上海水產大學.在實驗室使用純種小球藻飼喂自培養繁殖,選擇溞齡 6 ~24 h、孤雌生殖的雌性幼溞進行毒性試驗,試驗過程中不喂食.
羊角月牙藻:購自中科院水生生物所種質資源庫,藻種采用《農藥環境安全評價試驗準則》中推薦的 L9 培養液進行培養.
蚯蚓:赤子愛勝,購自天津市東麗區成功蚯蚓養殖場.蚯蚓在試驗前于試驗環境下培養 7 天,以紫花苜蓿顆粒作為蚯蚓的食物,選擇體重為 300 ~600 mg 的健康蚯蚓供試驗用.
1. 2 試驗介質
溞試驗介質為標準稀釋水,硬度 250 ±25 mg/L\\(以 CaCO3計\\),pH 值 6 ~ 9,溶解氧濃度在 7 mg/L以上.藻試驗介質為 L9 培養液,pH 值為 8. 0 ±0. 1.
蚯蚓試驗介質為人工土壤,由草炭、高嶺土、石英砂混合后置于 105 ℃條件下烘干,添加去離子水使其含水量控制在干重的 35 %左右 ,混合均勻.
1. 3 供試品
咯菌腈\\(原藥\\):純度 >98 %.
2 試驗方法
2. 1 大型溞急性毒性試驗
2. 1. 1 試驗條件
試驗光照強度為 1 000-1 500 LUX,光暗比為16∶ 8,試驗水水溫為 20 ±1 ℃.
2. 1. 2 試驗操作
試驗按等間距設置 5 個試驗組和一個空白對照組進行,試驗配制 0. 2、0. 3、0. 45、0. 68、1. 0 mg/L 的濃度系列,然后將其分裝到 100 ml 的燒杯中,每個燒杯裝 50 ml 的試驗液,每組設置四個平行,每只燒杯隨機挑取 5 只大型溞放入試驗液中進行試驗,大型溞為溞齡小于 24 h 的非頭胎幼溞,在燒杯上面加蓋蓋玻片.于 24 h、48 h 觀察記錄大型溞的活動抑制情況,試驗結果取四組平均值.用概率單位統計法計算半抑制濃度 48 h-EC50值及其 95 % 置信限\\(中華人民共和國農業部,2013\\).
2. 2 藻類生長抑制試驗
2. 2. 1 試驗條件
本試驗是在溫度23 ±1 ℃、光照強度為5 000 ~6 000 lux,光暗比為 14∶ 10,pH 值 8. 0 ± 0. 1 的條件下進行.
2. 2. 2 試驗操作
試驗按等間距設置 5 個試驗組和一個空白對照組進行,試驗配制 0. 2、0. 3、0. 45、0. 68、1. 0 mg/L 的濃度系列,得到受試物試驗溶液.分別取各濃度系列 100 ml 于 300 ml 三角瓶中,加入羊角月牙藻藻種,使藻種的細胞濃度為 1 ×10^4cells / ml,混勻.每個系列設置 3 個平行,同時設置空白對照組.將裝好的受試物試驗液的三角瓶放置于人工氣候培養箱中培養,于 24 h、48 h、72 h 時觀察并記錄藻在試驗溶液中的生長情況.采用概率單位法計算受試物對羊角月牙藻的半數生長抑制率 72 h-EC50值及其 95 %置信限.
試驗周期內平均生長率計算方法如下:
上式中:
μi-j表示從時間 i 到時間 j 的平均生長率;
Xi表示在時間 i 的藻細胞濃度;
Xj表示在時間 j 的藻細胞濃度;
將受試物濃度對數與平均生長率進行線性回歸,求得 EC50值.
2. 3 蚯蚓急性毒性試驗
2. 3. 1 試驗條件
本試驗是在溫度 20 ± 1 ℃、光照強度為 500 ~600 lux,連續光照.
2. 3. 2 試驗操作
試驗選擇 0、0. 1、1、10 mg ai/kg- 1干土3 個濃度組進行試驗,不設平行組,并同時進行空白對照組試驗.試驗選取馴養合格的蚯蚓隨機分至各組,每個容器中放入 10 條,試驗周期為 10 d.結果表明:在14 d 試驗中,在所有受試物試驗濃度中,蚯蚓均未發生死亡\\(中華人民共和國農業部,2013\\).
3 結果及分析
3. 1 咯菌腈對大型溞的毒性
在大型溞急性毒性試驗中,試驗于 24 h、48 h觀察記錄溞受抑制情況,結果如表 1 所示.將溞抑制率換算成概率單位后與咯菌腈濃度對數進行線性擬合,如圖 1 所示.根據線性方程采用概率單位法計算咯菌腈對大型溞的半抑制濃度 48 h-EC50值為 0. 55 mg/L,其95 %置信限為 0. 45 ~0. 77 mg/L,參照農藥溞類活動抑制試驗毒性分級標準,咯菌腈對溞的毒性為高毒.
3. 2 咯菌腈對羊角月牙藻的生長抑制毒性試驗分別于 0 h、24 h、48 h、72 h 用藻類計數儀對藻細胞進行計數,記錄不同濃度藻的生長量,結果取三組平行的平均值,結果見表 2.將試驗結果采用直線內插法進行統計分析,將咯菌腈試驗溶液濃度對數與 72 h 時對羊角月牙藻的生長抑制率進行線性擬合,繪制咯菌腈對羊角月牙藻的濃度-劑量效應曲線圖,結果如圖 2 所示.根據線性方程計算在 72 h 時咯菌腈對羊角月牙藻的半抑制濃度 72 h-EC50為 0. 66 mg/L,其 95 % 置信限為 0. 62 ~ 0. 74mg / L.參照農藥藻類生長抑制試驗毒性分級標準,咯菌腈對羊角月牙藻的毒性級別為中毒\\(中華人民共和國農業部,2013\\).
3. 3 咯菌腈對蚯蚓赤子愛勝的毒性
試驗于 14 d 試驗結束時觀察記錄蚯蚓赤子愛勝的死亡情況,試驗結果見表 3.根據試驗結果可知,咯菌腈對蚯蚓赤子愛勝的半致死濃度 LC50>10 mg ai / kg- 1干土.參照農藥蚯蚓急性毒性試驗分級標準,咯菌腈對蚯蚓的毒性級別為低毒\\(中華人民共和國農業部,2013\\).
4 結論
本文通過研究咯菌腈對大型溞、羊角月牙藻和蚯蚓的毒性,直接反映了咯菌腈對不同生物體毒性的大小,為咯菌腈在環境施用的風險評估提供了依據.在本試驗條件下,3 種不同的受試生物對咯菌腈表現出了不同的毒性,其在環境中的行為及生態效應表現出不同的毒性效應可能因生物或環境不一致導致不同生物的敏感性不同,在該試驗中,水生生物溞、藻均表現出較高的敏感性,對咯菌腈均表現出了一定的毒性,其施用將會對水環境造成一定的污染,在農業生產及施用過程中應謹慎,盡量避免對人和周圍環境造成危害.其對陸生生物蚯蚓表現出了較低毒性,可能是蚯蚓對咯菌腈本身不敏感,若要對咯菌腈毒性進行全面正確的評價,需進一步進行其它生物體急性及慢性毒性試驗研究,以綜合評價其對整個生態環境的潛在風險.
參考文獻:
中華人民共和國農業部,2013. 化學農藥環境安全評價試驗準則-溞類急性活動抑制試驗[S]. 中國標準出版社 .
中華人民共和國農業部,2013. 化學農藥環境安全評價試驗準則-藻類生長抑制試驗[S]. 中國標準出版社 .
中華人民共和國農業部,2013. 化學農藥環境安全評價試驗準則-蚯蚓急性毒性試驗[S]. 中國標準出版社 .
楊玉柱,焦必寧,2007. 新型殺菌劑咯菌腈研究進展[J]. 現代農藥,5\\(6\\):35-39.
張曉光,王列平,錢一石,等 . 2013. 咯菌腈原藥的高效液相色譜分析[J]. 農藥,52\\(6\\):427-428.
