0、 引言
玉米作為中國乃至全世界第一大糧食作物,是重要的糧食作物和飼料來源,同時也是全球總產量最高的經濟糧食作物. 而玉米絲黑穗病作為一種全球性的病害已經嚴重的影響了全球各地玉米的產量,同時也是制約我國玉米產業快速發展的主要病害之一. 玉米絲黑穗病又名烏米、啞玉米等,在華中、華北、華南、東北、西北和西南地區都普遍發生. 2002 年東北地區玉米絲黑穗病大面積的發生,其平均發病率為 10% ~ 15%,嚴重的地區高 70% ~ 80%. 隨著玉米感病品種的大規模種植,玉米絲黑穗病的發病率一年高過一年,并且已經成為了危害我國玉米產量的重要病害. 因此,尋找一種能夠快速且有效的方法對玉米絲黑穗病進行檢測顯得尤為重要,為研究絲孢堆黑粉菌的致病機理,尋找防治該病害的新途徑、新方法提供技術支持.
在對植物進行某種病原檢測中,通常使用的是 PCR 檢測技術. PCR 技術用來檢測病原物是指選擇某一特定的引物去擴增相應的目的 DNA片段. 該實驗所采用的引物是由上海生工生物公司合成的玉米絲黑穗病菌的特異性引物\\(GSP\\) ,然后采用 PCR 擴增檢測技術可以對玉米病苗中的絲黑穗病菌基因組進行特異性的擴增,對擴增的樣品 DNA 進行濃度為1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳,最后在凝膠成像系統中進行觀察和記錄,從而得知玉米是否感染了絲黑穗病. 最后計算出該特異性引物 GSP 對玉米病苗的檢測效率,看是否可以用于快速有效的對玉米感病植株在發病之前對病菌進行檢測.
1 材料與方法
1. 1 材料準備
\\(1\\) 絲黑穗冬孢子的觀察
稱取 10 mg 已經處理好的玉米絲黑穗病菌冬孢子粉,將其置于 1. 5 mL 的離心管中,加入適量的無菌水浸泡過夜,然后置于高速離心機中離心 2 min\\(10000 r/min\\) ,棄掉上清液. 再用無菌水處理 1 d,再次離心并棄掉上清液. 將已經處理好的冬孢子沉淀浸泡于配置好的 2% 葡萄糖溶液中,置于 28 ℃的溫箱中黑暗培養3 d,3 d 后觀察冬孢子的萌發狀態.
\\(2\\) 試驗材料及病菌
玉米感病品種\\(黃早 4\\) ,植物 DNA 提取試劑盒\\(寶生物公司購買\\) ,供試絲黑穗病菌\\(將事先收集好的病菌樣品置于室內晾干,再用篩子充分篩選出孢子粉,將孢子粉置于通風、陰涼、干燥處保存備用\\) .
\\(3\\) 配置菌土
土壤采樣后放入高壓滅菌鍋中進行滅菌,待土壤冷卻后加入玉米絲黑穗菌粉配置成 1% 的菌土.
\\(4\\) 播種與接種
選取 200 粒感病品種黃早 4,將種子在 4 月20 日播種于吉林省農業科學院所屬的玉米試驗田\\(公主嶺\\) ,每穴 2 ~3 粒,將配置好的菌土覆蓋在玉米種子上.
\\(5\\) 取樣
在玉米抽穗前期\\(此時病狀并未表現出來\\)對玉米的根與葉片組織進行采樣.
1. 2 試驗方法
1. 2. 1 DNA 的提取方法\\(采用試劑盒提取,提取方法參照說明書\\)
將采集的每份玉米根與葉片的樣品取適量置于研缽中用液氮充分的研磨,將研磨好的樣品組織\\(不多于 50 mg\\) 分裝于 1. 5 mL 的離心管中,并分別做好標記. 加入400μL LE Buffer,上下顛倒混合均勻,迅速置于 65℃ 環境中溫浴 15 ~30 min\\(期間可震蕩離心管 2 - 3 次\\) ,然后移出.
然后向離心管中加入 130 μL DA Buffer,充分混勻,在冰盒中放置 5min,再放入 Sigma 微量臺式離心機中 14000 r 離心3 min,待離心完成后用移液器吸取上層清液,將上清液轉移至一個已滅菌的 1. 5 mL 離心管中. 加入 750 μL 的 E BindingBuffer\\(使用前已按說明加入了 28 mL 的無水乙醇\\) ,上下顛倒混勻后將混合液轉移至 Spin col-um 中,在高速離心機中 6000 r 離心 1 min,并倒掉接液管中的液體,因為此時的混合液體積大于750 μL,所以需要分 2 次進行離心過柱. 之后向Spin colum 中加入 500 μL 的 G Binding Buffer,于10000r 離心 30s,并倒掉接液管中的液體. 在 Spincolum 中加入 600 μL 的 Wash Buffer\\(使用前已按說明加入了 37. 8 mL 的無水乙醇\\) . 于 10000 r離心 30 s,倒掉接液管中的液體,再重復此步驟一次. 然后將 Spin colum 轉移至一個新的1. 5 mL的離心管中,向其中加入 100 μL 的 Elution Buff-er,放于室溫溫浴 1 min 后,最后于離心機中12000 r 離心 1 min,并棄掉 Spin colum,此 1. 5 mL的離心管中的液體含有所需 DNA,置于 - 20 ℃環境中保存備用.
1. 2. 2 DNA 純度的檢測
隨機抽取已提取的樣品 DNA 進行電泳檢測,每個隨機樣品取 5μL 于 1. 5% 的瓊脂糖凝膠中進 行 電 泳,電 流 180mA,電 壓 180V,電 泳15min,于凝膠成像系統中觀察 DNA 的降解情況及是否有 RNA 的影響.
PCR 檢測:
\\(1\\) 所使用的引物購買于上海生工生物公司,引物 GSP 的序列為上游 5’- TCGCCGACGGATGATAATCG -3’下游 5’- GAGTCACCCGCCCAAAGTTA - 3’
\\(2\\) 反應程序: 共設置 35 個循環,步驟如下:94 ℃ \\(預變性\\) 4 min→94℃\\(變性\\) 1 min→54℃ \\(復性\\) 1 min→72 ℃\\(延伸\\) 1. 5 min→72 ℃\\(延伸\\) 5 min→4 ℃環境中保存備用
\\(3\\) 1. 5%瓊脂糖凝膠電泳用萬分之一天平稱取適量的瓊脂糖,加入適量的已配置好的 TAE 溶液配制成 1. 5% 凝膠,用微波爐將其沸騰一次后加入適量的 EB,趁熱倒入插好梳子的制膠槽中,待凝膠凝固后加入 PCR的產物,10 μL 的樣品,并加入 DNA Marker.
\\(4\\) 電泳的結果在凝膠成像系統中進行觀察和記錄.
2、 結果與分析
2. 1 玉米絲黑穗冬孢子萌發情況的觀察從溫箱中取出已培養 3 d 的玉米絲黑穗冬孢子,吸取適量的冬孢子滴于載玻片的中央,并滴幾滴無菌水后蓋上蓋玻片,至于電子顯微鏡下觀察其萌發狀態. 結果如下.冬孢子萌發前的狀態,在將其至于 2%的葡萄糖溶液中,28℃黑暗培養 3 d 后,其萌發狀態. 說明該絲黑穗冬孢子粉具有活性且能正常萌發,可以使用其對玉米進行侵染.
2. 2 DNA 的提取與檢測
將采用試劑盒方法提取的 DNA 樣品,經瓊脂糖凝膠電泳檢測,結果表明,用試劑盒所提取的樣本組織的 DNA 可以獲得高質量的 DNA,可以用于后續的實驗.
2. 3 PCR 結果檢測
2. 3. 1 玉米葉片組織中絲黑穗病原菌的檢測為帶病玉米植株葉片組織 DNA的電泳結果,其中 M 是 DNA Marker,1 ~10,13 ~22 均為黃早 4 未發病葉片組織 DNA,11、23 均為水\\(CK\\) ,12、24 均為玉米絲黑穗病菌的 DNA. 根據圖 4 可知,以玉米葉片 DNA 為模板進行病菌PCR 檢測發現只擴增出了 3 條與玉米絲黑穗病菌在同一范圍內的譜帶,其中 5 號較為明顯,14號、21 號均不明顯,病菌的檢測效率僅為 15%.
2. 3. 2 以玉米根組織中絲黑穗病原菌的檢測為帶病玉米植株根組織 DNA 的電泳結果,其中 M 是 DNA Marker,1 ~10,13 ~22均為黃早 4 未發病根組織 DNA,11、23 為水\\(對照\\) ,12、24 為玉米絲黑穗病菌的 DNA. 以玉米葉片 DNA 為模板進行病菌 PCR 檢測發現擴增出了 16 條與玉米絲黑穗病菌在同一范圍內的譜帶,僅有 2 號、3 號、5 號沒有擴增出譜帶,13 號不太明顯,病菌的檢測效率為 80%.
3 結論與討論
通過選用玉米感病品種黃早 4 抽穗前期的葉片和根組織的 DNA 進行提取,然后采用玉米絲黑穗病菌的特異性引物\\(GSP\\) 進行 PCR 擴增檢測. 結果發現以葉片的 DNA 為模板進行 PCR檢測時,其檢測效率僅僅為 15% 并不能對病苗是否帶有玉米絲黑穗病菌進行有效的檢測. 而以根組織的 DNA 為模板進行 PCR 檢測,發現其檢測效率為80%,遠遠高于葉片 DNA 的檢測效率.
因此可以快速有效的對玉米幼苗在發病前期檢測出植株是否感染了玉米絲黑穗病.
在 PCR 擴增的反應程序中將退火溫度設置為 54 ℃\\(根據引物 GSP 的特性設置了 3 個退火溫度梯度,分別是 53 ℃、54 ℃、55 ℃,其余條件均不變的情況下發現,當退火溫度為 54 ℃ 時凝膠電泳檢測圖譜最為清晰\\) ,35 個循環時,以玉米絲黑穗病菌的特異性引物 GSP 對玉米絲黑穗病病苗中的病菌進行檢測發現,其病菌的檢測率達到 80%,因此可以用于快速且有效的在玉米絲黑穗病的發病前期對絲黑穗病菌進行檢測,提早進行防治,降低玉米絲黑穗病對玉米產量的影響.
在對玉米絲黑穗病進行 PCR 研究時,通常提取的是玉米下部組織的 DNA 而不采用玉米葉片組織的 DNA. 通過查閱相關的文獻發現,玉米絲黑穗病屬于幼苗期侵染的一種系統性的病害,絲黑穗的病原菌以散落在土壤中、混入到糞肥中或附著在玉米種子表面的冬孢子越冬,第二年成為主要的傳染源,其中以土壤帶菌侵染為主.
病原菌于種子萌發開始從根莖、胚芽以及芽鞘侵染,并且在植株體內形成菌絲,跟隨著植物向上生長. 因此,在玉米植株的下部組織 DNA 中的病原菌濃度要遠遠大于上部組織 DNA 中的病原菌濃度,而葉片中的病原菌數量要低于莖髓組織和根部組織甚至是沒有\\(如圖4 所示\\) ,因為病原菌菌絲是選擇性的對植株的部位進行侵染的,若選擇侵染葉片則不利于病原菌的繁殖. 玉米絲黑穗是一種比較復雜的病害,目前對它的發病機制了解還不是很透徹,而針對玉米品種的抗性而言,目前尚無絕對的免疫品種,抗病與不抗病是相對的概念,只有做到早檢測、早發現、早防治才能將玉米絲黑穗病的危害降到最低,才能保證玉米的產量. 隨著現代科學技術的不斷發展,有關玉米分子遺傳學和基因組學的研究領域也在不斷向更深層面發展,隨著人們對玉米絲黑穗病的探索和研究越來越深入,將會有助于推進玉米抗絲黑穗病育種取得新的研究進展.
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