非編碼 ＲNA 在基因調控方面有著重要功能，可廣泛參與基因調控的各個層面，在發育、癌癥、神經功能紊亂等生物過程中都發揮重要作用［1］。在長非編碼ＲNA 中有一重要亞類，天然反義轉錄本，是從已知轉錄序列的互補鏈轉錄的轉錄物［2］。有學者提出一些分子模型來解釋天然反義 ＲNA 產生功能的分子機制，如轉錄干擾、ＲNA 遮蔽、雙鏈 ＲNA 降解、翻譯干擾等［3］。已經有研究表明，長非編碼 ＲNA 與轉錄因子的編碼基因有著更密切的聯系［4］。Dlx1as 是眾多天然反義 ＲNA 中較早被發現的，但到目前為止，關于其具體生物學功能的報導很少。Dlx1as 在基因座位上位于進化上極其保守的兩個轉錄因子 Dlx1 與 Dlx2之間［5-6］。Evf 2 作為 Dlx1 同源蛋白 Dlx5-Dlx6 基因座位中的天然反義轉錄物，已被證實可以反式調節另一個同源基因 Dlx2［7］。本研究以小鼠的大腦發育為模型，檢測與探討了 Dlx1as 在發育過程中的表達，分析 了 其 對 Dlx1 編 碼 基 因 產 生 影 響 的 可 能機制。
一、材料和方法
材料 pGEM-T 載體、質粒提取試劑盒、DNA 純化試劑盒購自天根生化科技 \\( 北京\\) 有限公司，反轉錄試劑盒購自全式金生物科技公司，實時定量 PCＲ 試劑盒、ＲNase-Free DNaseI 購自日本 Takara 公司，Trizol購自美國 Invitrogen 公司，T4 DNA 連接酶購自美國Promega 公 司。 E12. 5、 E14. 5、 E16. 5、 E18. 5、 P1、P7 及成年小鼠品系均為 ICＲ 品系，由中國醫學科學院基礎醫學研究所實驗動物中心飼養。冰凍切片機為萊卡 CM1950 \\( 實驗室器材\\) 。
組織 ＲNA 的提取及去 DNA 處理 取新鮮鼠腦組織，按照 1 mg 組織∶1 ml 的比例加入 Trizol，使用高速勻漿器進行破碎，之后加入 200 μl 氯仿抽提，4℃12 000 r / min離心 20 min; 吸取上清 500 μl，加入等體積異丙醇，4℃放置 1 h，4℃ 12 000 r/min 離心 20 min;棄上清，75% 乙醇 1 ml 漂洗 2 次，晾干，加入適量DEPC 水溶解。按照 10 μg 總 ＲNA 加入 10U DNaseⅠ與相應體積的 10 × buffer，37℃反應 30 min，70℃熱失活 5 min。
ＲT-PCＲ 使用 2 μg 總 ＲNA 作為模版，1 μl\\( 50 pm\\) OligdT 作為引物，2 × buffer 10 μl、反轉錄酶1 μl、DEPC-水補足 20 μl 體系。陰性對照的 PCＲ 體系中未加逆轉錄酶。
實時定量 PCＲ 用等量 cDNA 作為模版，20 μl總體系，0. 5 μl-Primer-F，0. 5 μl-Primer-Ｒ，10 μl-2 ×Mix，使用 GAPDH 為內參，對 Dlx1 mＲNA 與 Dlx1as 進行定量檢測。實時定量 PCＲ 引物序列見表 1。
克隆與測序 將 ＲT-PCＲ 得到的特異條帶進行切膠回收，用 DNA 純化試劑盒純化，將純化的 DNA 產物連接到 pGEM-T 載體，連接產物轉化至大腸桿菌 DH5α感受態細胞中，菌落 PCＲ 鑒定陽性克隆，接菌，送美國 Invitrogen 公司測序部進行測序。
ＲNA 探針制備 使用將 Dlx1as 與 Dlx1 mＲNA 的片段克隆到 pGEM-3Zf 載體，分別使用 BamHⅠ與 HindⅢ進行線性化，醇沉回收線性化質粒，使用 T7 轉錄酶體系進行體外轉錄，ＲNase-Free DNaseⅠ消化模版，醇沉，漂洗，50μl DEPC-水溶解，加入等體積甲酰胺，標定濃度為 50 ng/μl，分裝使用。
原位雜交 使用冰凍切片機，將不同天數的鼠腦進行切片，使用雜交液進行預雜交，使用0.5 ng/μl 的終濃度探針，65℃ 雜交過夜，使用 0. 2 × SSC，65℃，洗脫20 min，重復 3 次，使用地高辛抗體 1∶ 5000，4℃ ，雜交過夜，進行顯色反應，中性樹脂進行封閉保存。使用尼康顯微鏡進行拍照記錄。
二、結 果
Dlx1as 分子具有多聚腺苷酸尾 使用 UCSC 公共數據庫的 polyA 信號分析，在 Dlx1as 的末端有 1 個強烈的特征信號，強度比 Dlx1 mＲNA 更高; 采用 OligdT和 Ｒandom primer 進行反轉錄，以得到的 cDNA 為模版進行 PCＲ 擴增，陰性對照未見條帶，目的片段大小符合預期，連接 pGEM-T 載體，測序正確 \\( 圖 1\\) 。
Dlx1as 和 Dlxl mＲNA 在小鼠大腦胚胎期高表達Dlx1as 和 Dlx1 mＲNA 在神經發育過程中出現了一段時間 內 的 高 表 達，從 E14. 5 持 續 到 E18. 5，除 在E12. 5 和成年小鼠中有顯著性差異外，其余 4 個時間點均沒有顯著性差異。使用曲線擬合，計算得出 Ｒ2=0. 71 ，P = 0. 19 \\( 圖 2\\) 。
Dlx1as 與 Dlx1 mＲNA 在空間表達上具有互補性從 E12. 5、E14. 5 和 E16. 5 的時間點中，都能夠看出二者的表達部位有明顯的差別，雖然二者均較特異表達于大腦腹側生發區，但 Dlx1 mＲNA 在室周區較室周下表達量更高，而 Dlx1as 則與之相反 \\( 圖 3\\) 。
三、討 論
越來越多的證據表明，一些長非編碼 ＲNA 的轉錄使用和 mＲNA 相同的轉錄機器，具有多聚腺苷酸尾，有可變剪切形式。本研究鑒定了經典的天然反義ＲNA—Dlx1as 具有多聚腺苷酸尾。在特定的時空表達的ＲNA 分子，很可能會參與特定的生物學過程。Dlx1as在小鼠胚胎期大腦中高表達，與成年的低表達形成鮮明的對比，揭示 Dlx1as 很可能在大腦發育過程成具有重要功能。而且 Dlx1as 與 Dlx1 mＲNA 的表達趨勢非常類似，筆者認為可能是整個基因座位的轉錄被激活所導致，當然也不能排除二者的轉錄分別受到調控，還需要進一步的驗證轉錄的上游控制。
天然反義 ＲNA 很多都通過影響 mＲNA 來產生效應，例如天然反義 ＲNA Star 的表達可以降低 StAＲ 的蛋白表達，在體敲低 Bdnf-AS 的表達水平，可以使 Bdnf 的表達水平得到大幅度的增強［8-9］。因此筆者推測 Dlx1as 很可能也是通過類似方式來實現其功能的。本研究通過原位雜交，發現 E12. 5、E14. 5 和 E16. 5 的胎腦中，在腦室室周，Dlx1as 與 Dlx1 mＲNA 有著明顯的位置不同，甚至是接近互補的存在，由此推測 Dlx1as 可能是通過對 Dlx1 mＲNA 的負調控來發揮功能的。在筆者撰寫文章的同時，有新加坡的實驗室發表了關于 Dlx1as 敲除小鼠的研究，并提出了Dlx1as 通過負向調節Dlx1 mＲNA的分子模型，與筆者推測相符［10］。至于更加詳細的分子調控機制，還需要進行更加深入細致的研究。
參 考 文 獻
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