家蠶\\( Bombyx mori\\) 基因組框架圖、精細圖以及各種數據庫的相繼建立和不斷完善，為發掘和鑒定家蠶基因、研究基因的生物學功能及應用前景奠定了良好的信息平臺基礎。lemon \\( lem\\) 是一種典型的黃體色家蠶突變體，其幼蟲體表富含墨蝶呤\\( se-piapterin，SP\\)。SP 屬于喋啶類化合物，是 GTP 分解代謝途徑的中間產物。在高等動物中，SP 是補救途徑合成四氫生物蝶呤\\( tetrahydrobiopterin，BH4\\) 的前體，經墨蝶呤還原酶\\( sepiapterin reductase，SPR\\) 和二氫葉酸還原酶\\( dihydrobiopterin reductase，DHFR\\)催化完成\\( 圖 1\\)?！緢D略】

SPR 是以 NADPH 為輔酶催化蝶啶衍生物代謝的醛酮還原酶，由 GTP 分解到 BH4 生成的從頭合成途徑中，SPR 是催化最后一步反應的必需酶，對于生物體合成 BH4 具有非常重要的生理功能。BH4是芳香族氨基酸羥化酶的必需輔酶，也是一氧化氮合酶的重要輔助因子。BH4 的合成不足會導致神經遞質的缺乏以及細胞內皮功能障礙，引發多種神經性生理代謝疾病。我們的前期研究表明，家蠶 SPR\\( BmSPR，Gen-Bank 登錄號: AB465548 \\) 基因 \\( BmSpr\\) 的全長 ORF為 801 bp。與哺乳動物 SPR 類似，BmSPR 是家蠶體內合成 BH4 的重要酶之一，其活性的嚴重缺乏會導致幼蟲因 BH4 的合成不足而死亡。家蠶 lem 突變體是提取和純化獲得天然 SP 的重要遺傳資源。

為了將從 lem 中大量提純的 SP 應用于 BH4 的體外生物合成研究，本文對重組質粒 pET-24b-BmSpr 的原核表達系統進行了優化，得到了穩定表達 BmSPR 融合蛋白的實驗條件，并對純化獲得的重組蛋白進行了酶學鑒定及活性分析。

1 材料與方法

1． 1 材料及主要試劑
重組質粒 6 × His pET-24b-BmSpr 由本實驗室前期構建; E． coli 感受態細胞 Rosetta \\( DE3\\) 和 BL21\\( DE3\\) 購自北京全式金公司; PCR 擴增相關試劑購自 TaKaRa 公司; Anti-His Antibody、羊抗鼠 IgG-HRP、HRP-DAB 底物顯色試劑盒為 Tiangen 公司產品; 蛋白純化、蛋白定量試劑盒分別為 QIAGEN 公司和上海生工生物工程有限公司產品; PD-10 蛋白脫鹽柱購自 GE 公司; Immobilon-P PVDF 膜為 Millipore 公司產品; SP 標準品及 NADPH 購自 Sigma 公司，其他試劑均為國產分析純。

1． 2 菌落 PCR
1． 2． 1 檢測陽性克隆的引物序列正向引物: M13F，5＇-GTTTTCCCAGTCACGAC-3＇;反向引物: M13R，5＇-CAGGAAACAGCTATGAC-3＇。

1． 2． 2 PCR 反應體系 25 μL 反應體系中含 10 ×擴增緩沖液 2． 5 μL，0． 3 U Tag 酶和 0． 2 ～ 0． 5 μg 模板 DNA，dNTP Mix、正反向引物的終濃度分別為 0． 8mmol / L、0． 4 μmol / L 和 0． 4 μmol / L，最后用 ddH2O補齊。

1． 2． 3 PCR 反 應 參 數 的 設 定 95 ℃ 預 變 性10 min，反應 25 個循環，每個循環包括 94 ℃ 變性55 s，54 ℃ 退火 58 s，72 ℃ 延伸 1 min。循環結束后72 ℃ 延伸 10 min，反應產物用 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測確認。

1． 3 優化重組蛋白表達條件
運用熱擊法將 pET-24b-BmSpr 重組質粒分別轉化到 BL21 \\( DE3\\) 及 Rosetta \\( DE3\\) 菌株感受態細胞，37 ℃ ，150 r / min 活化一個小時后，將 100 μL 菌液均勻涂布于 LB 平板\\( 含 15 μg/mL Kanamycin\\) ，37 ℃培養過夜。挑取經菌落 PCR 鑒定的陽性克隆，接種到含 Kanamycin 的 LB 液體培養基中，37 ℃，180 r/min 震蕩培養至 OD600≈0． 5 時，加入 1． 0 mmol/L 的IPTG 誘導重組蛋白的表達，對照組不加 IPTG。誘導4 h 后，收集菌體，超聲波破碎，離心，分別收集上清和細胞沉淀，進行 SDS-PAGE 檢測，分析不同菌株中重組 BmSPR 蛋白的表達情況。以 1． 0 mmol/L 的 IPTG 誘導濃度，對照組不加IPTG，分別使用 4 ℃ 、16 ℃ 、28 ℃ 和 37 ℃ 誘導培養4 h后，收集菌體總蛋白進行 SDS-PAGE 檢測，分析不同誘導溫度下重組 BmSPR 蛋白在 Rosetta \\( DE3\\) 宿主菌中的表達情況。使用不同濃度 梯度的 IPTG\\( 0．2、0．4 、0．6 、0． 8 、1． 0 、1． 2 、1． 5 和 2． 0 mmol/L\\)和不 同 誘 導 培 養 時 間 \\( 0、1、2、3、4、5 和 6 h\\) ，于 37 ℃誘導重組蛋白在 Rosetta \\( DE3\\) 中的表達。收集菌體總蛋白進行 SDS-PAGE 檢測，分析重組蛋白在不同誘導條件下的表達情況。

1． 4 大量誘導表達融合蛋白
在 37 ℃培養條件下，用 250 mL 的 LB 液體培養基培養含重組質粒 pET-24b-BmSpr 的 E． coli Rosetta\\( DE3\\) 的陽性菌株，用 0． 4 mmol/L 的 IPTG 誘導重組蛋白的表達，最后破碎細胞收集上清液，進行 SDS-PAGE 檢測。

1． 5 蛋白純化及免疫印跡檢測
擴大培養后，4 ℃ 8 000 r/min 離心 10 min 收集E． coli 細胞，超聲破碎，并收集細胞破碎上清液。參照說明書，用 Ni-NTA 親和層析柱\\( QIAGEN\\) 對重組蛋白進行純化。經 10% SDS-PAGE 電泳檢測確認后，將凝膠上的蛋白轉至 PVDF 膜上，以 His-Tag 單克隆抗體\\( Tiangen\\) 為一抗，羊抗鼠 IgG-HRP 抗體\\( Tiangen\\) 為二抗，進行 Western blot 分析，然后參照 HRP-DAB 顯色試劑盒 \\( Tiangen\\) 說明書進行顯色反應。

1． 6 酶活特性分析
使用 BCA 法試劑盒\\( 上海生工\\) 對純化后的蛋白進行定量，并參照 Katoh的方法，進行 SPR 酶活性分析。反應體系為 0． 1 mL\\( 含 100 mmol/L 磷酸鉀緩沖液 pH 6． 4，SP 50 μmol/L，NADPH 100 μmol/L\\) ，加入 0． 2 μg 重組酶蛋白，37 ℃ 反應 10 min 后，在420 nm 處測定底物 SP 的 OD 值變化。對照組則不加重組蛋白。根據反應前后 SP 吸光值的變化和標準曲線計算酶活單位。酶活力單位定義為: 每分鐘還原 1 nmol SP 所需的酶量 \\( nmol/min·μg-1\\) 。設定不同 梯度的溫 度 \\( 20-90 ℃\\) 和 反 應 液 pH \\( 20mmol / L Britton-Robinson buffer，pH 2． 0-12． 0 \\) ，檢測不同溫度及 pH 對酶活性的影響，探究重組蛋白的最適反應條件。

2 結果與分析

2． 1 BmSPR 體外表達條件的優化
篩選轉化成功的重組質粒陽性克隆，經菌落PCR 排除假陽性，并經測序\\( 上海生工\\) 確認序列準確無誤，用 IPTG \\( 1． 0 mmol/L\\) 誘導重組子在不同宿主細胞的表達。菌落 PCR 結果如圖 2 所示，PCR 產物大小約為 800 bp，與預期相符。SDS-PAGE 結果顯示，經 IPTG 誘導后，在 E． coli 菌株 Rosetta \\( DE3\\) 及BL21 \\( DE3\\) 的細胞破碎上清液中均出現大小約為30 kDa 的特異性條帶，與目的蛋白的預測分子量相符，且兩菌株之間的表達量沒有明顯差異 \\( 圖 3\\) ，在細胞沉淀中目的蛋白的表達量相對較少\\( 數據未附\\) ?！緢D2-3.略】

以 Rosetta\\( DE3\\) 為宿主菌，使用 1． 0 mmol/L 的IPTG 誘導，分別以 4 ℃ 、16 ℃ 、28 ℃ 和 37 ℃ 誘導表達 4 h，分析重組蛋白在不同誘導溫度條件下的表達情況。結果如圖 4 所示，無 IPTG 誘導時，SDS-PAGE未檢測到目的蛋白的表達，37 ℃ 誘導條件下目的蛋白的表達量明顯高于其他誘導溫度。

以 Rosetta\\( DE3\\) 為宿主菌，在 37 ℃ 的培養條件下，通過改變 IPTG 濃度 \\( 0． 2-2． 0 mmol/L\\) 及培養時間 \\( 1-6 h\\) ，分析重組蛋白在不同誘導培養條件下的表達情況。結果如圖 5 所示，無 IPTG 誘導時，SDS-PAGE 未檢測到目的蛋白的表達，而不同 IPTG誘導濃度\\( 圖 5A\\) 之間及不同誘導時間\\( 圖 5B\\) 之間對目的蛋白的表達量幾乎沒有影響，表明重組蛋白在該表達系統能夠穩定表達。

2． 2 BmSPR 蛋白的純化及 Western blot 檢測
根據 上 述 表 達 條 件 的 優 化 結 果，以 E． coliRosetta \\( DE3 \\) 菌株為宿主菌，用 0． 4 mmol / L IPTG大量誘導 BmSPR 的體外表達，培養 3 h 后破碎細胞，收集上清液蛋白，SDS-PAGE 確認了重組蛋白的表達\\( 圖 6A\\) ?！緢D略】

用 Ni-NTA 親和層析柱對重組 BmSPR 蛋白進行純化，SDS-PAGE 檢測得到符合預期分子量大小的單一條帶，初步說明重組蛋白純化效果較佳 \\( 圖 6B\\) 。

Western blot 檢測發現，經 IPTG 誘導且純化過的蛋白得到特異性條帶，而對照組\\( 未經誘導\\) 沒有檢出信號，再次證明了所表達和純化的蛋白為目的重組蛋白 BmSPR\\( 圖 6C\\) ?！緢D略】

2． 3 BmSPR 的酶活性分析
如圖 7A 所示，BmSPR 在 40-70 ℃ 的溫度范圍內，保持較高的活性，50 ℃為最適反應溫度。為分析pH 對 BmSPR 活性的影響，使用終濃度為 50 mmol / L不同 pH \\( 2． 0-12． 0\\) 的 Britton-Robinson buffer，酶蛋白加入各反應體系，于 37 ℃反應 10 min 后計算酶活性。如圖 7B 所示，BmSPR 在 pH 4-6 之間表現出較高的酶活性，pH 5 為最適 pH 值。3 討論本實驗用 E． coli 不同菌株 \\( 圖 3\\) ，通過改變誘導溫度、IPTG 誘導濃度和誘導時間對家蠶 SPR 的體外表達條件進行了優化 \\( 圖 4，圖 5\\) ，最終選用 E．coli Rosetta \\( DE3 \\) 對其進行大量誘導表達分析，SDS-PAGE 和 Western blot 的檢測結果表明 BmSPR融合蛋白能夠在原核表達系統中穩定表達\\( 圖 6\\) ?！緢D略】

以 SP 為反應底物，用分光光度法分析所純化蛋白的酶活性的數據顯示，當溫度為 50 ℃、pH 值為 5 時，BmSPR 對 SP 表現出良好的催化活性\\( 圖 7 \\) ，為通過表達重組 BmSPR 的方式，開展體外合成制備 BH4 的課題研究提供了重要依據。

作為芳香族氨基酸羥化酶和一氧化氮合酶的重要輔酶，BH4 的合成缺陷會引起肌張力低下、不明原因的高熱、發育遲緩、腦脊液中神經遞質代謝產物的濃度偏低等神經系統疾病; 同時也是導致高血壓、動脈粥樣硬化、糖尿病等內皮功能異常的重要原因?？诜?BH4 已被作為臨床治療其中某些疾病的常規方案。然而經化工合成市售的 BH4 價格非常昂貴。因此，低耗高效的 BH4 生產工藝的開發創立顯得十分必要。隨著與 BH4 合成相關的酶如 GTPCHI、PTPS、DHPR、SPR以及 DHFR等的研究日益增多，酶基因的克隆與功能鑒定，蛋白質晶體結構的探明，使得 BH4 合成代謝的調控通路愈發清楚。這些研究一方面有助于加速對 BH4 缺乏癥實現基因治療的進程，另一方面為非化工途徑合成 BH4 的應用基礎研究奠定必要的理論基礎。

原核表達系統是目前應用最普遍的基因工程蛋白表達系統，具有操作 簡 單、高 效 低 廉 等 明 顯 優勢。我們利用大腸桿菌表達系統，獲得了純度較高、催化活性較好的重組 BmSPR\\( 圖 6，7\\) 和 BmDH-FR。家蠶 lem 突變 體 的 幼 蟲 體 表 沉 積 大 量 的SP，本課題組已建立了從 lem 蠶高效地分離純化 SP 的實驗體系，并且對 BH4 的補救合成途徑所需要的兩個酶進行了分子克隆和功能分析。

下一步我們打算利用從 lem 突變體大量提取的 SP 為底物，篩選共表達 BmSPR 和 BmDHFR 的工程菌，進行體外合成制備 BH4 的研究試驗，以期獲得一種較為簡便有效的合成 BH4 的方法。